铜负荷大鼠脑组织Cu、Zn、Fe分布及其对神经元细胞损伤的机制

王佳炜，侯焕喜，王 训，吴君霞，程 楠，韩咏竹，胡纪源，杨任民

(1安徽中医学院，合肥230038;2淮北矿工总医院;3安徽中医学院神经病学研究所附属医院)

Cu是机体必需微量元素之一，对维持神经系统的正常结构和生理功能具有重要作用。但当Cu摄取过多或由于遗传因素所致的Cu 在体内蓄积会导致体内Cu代谢相关酶和蛋白质的活性受抑制，继而影响肝、脑、肾等脏器的功能。Cu负荷大鼠模型可以较好地模拟肝Cu沉积诱导肝损伤的病理过程，且具有简单实用、重复性好等特点，是研究Cu代谢障碍性疾病较为理想的动物模型［1］。我们在前期研究［2］中发现，Cu负荷大鼠模型血清及肝组织Cu含量较对照组均明显增高，血清ALT也明显升高，提示肝脏Cu的沉积可影响肝功能。由于许多Cu代谢障碍性疾病患者除了有肝损害外，还可表现为神经系统症状。为此，2012年6～10月，我们观察了Cu负荷大鼠不同脑区脑组织Cu、Zn、Fe的分布及脑组织氧化应激指标的改变，为研究Cu对神经元细胞损伤的机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料 健康雄性Wistar大鼠50只，3月龄，体质量(210±25)g，由安徽省实验动物中心提供，许可证号:SCXK(皖)2011-002。饲养于安徽中医学院神经病学研究所动物房，饲养条件:每日光照14 h、黑暗10 h，室温(20±2)℃中笼养。微量分析天平(TG332，上海天平仪器厂)，微量移液器(Finnpipette，芬兰)，微波消解仪(WX-3000，上海屹尧仪器科技发展有限公司)，等离子体质谱仪(XSERAESⅡ，美国热电公司)，等离子体光谱仪(ACAT-6300，美国热电公司)，超低温冰箱、普通冰箱(荣事达冰箱厂)，可控恒温水浴锅(GKC8214型，江苏通州实验仪器厂)，低速台式离心机(DKDC-40，科大创新股份有限公司)，漩涡混匀器(XH-B，江苏康健医疗用品有限公司)，微量振荡器(BL-2DQ-OA，YDME)，分光光度仪(Biotecnica-instrument，S.P.N)，日立全自动生化分析仪(7020型，日本)。超纯水、超纯浓硝酸Ⅳ～Ⅴ级(北京化工厂)，丙二醛(MDA)试剂盒、铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2 方法

1.2.1 Cu负荷大鼠模型的建立 随机将大鼠分为模型组、对照组各25只。模型组给予含硫酸铜1 g/kg的粉状饲料和0.185%硫酸铜水，对照组给予正常喂食、饮水，喂养4周。与对照组比较，模型组体质量增长明显缓慢，皮毛欠光泽，饮食、饮水量明显减少，容易激惹，且出现肢体强直扭转，即为造模成功。

1.2.2 不同脑区脑组织Cu、Zn、Fe含量的测定 继续喂养至第12周结束，对照组全部存活，模型组存活23只。随机选取模型组10只、对照组11只，腹腔内注射10%水合氯醛麻醉后，打开其腹腔，腹主动脉取血后，经3 000 r/min离心10 min后，取血清置入EP管中，待测Cu/Zn-SOD、MDA;然后经开颅，在冰上小心取出脑组织。经双蒸水反复冲洗表面血液后，以滤纸吸干表面水分，分别称取额叶、顶叶、颞叶、顶叶、枕叶、基底结区、脑干及小脑组织各0.2 g，送安徽地质实验研究所行微波消解，以等离子体原子发射光谱法检测各脑区组织Cu、Zn、Fe含量。

1.2.3 血清、不同脑区脑组织中Cu/Zn-SOD、MDA的测定 第12周结束时，随机选取模型组9只、对照组11只，腹腔内注射10%水合氯醛深麻后，打开其腹腔，腹主动脉取血后，经3 000 r/min离心10 min后，取血清置入 EP管中，待测 Cu/Zn-SOD、MDA。分别选取9只在冰上小心取出脑组织。用上述方法取出脑组织用冰冷生理盐水冲洗干净表面血液，再用用滤纸吸干表面水分，然后称取大脑皮层及基底节区组织各0.3 g，加入冰冷生理盐水制成10%的匀浆液，3 000 r/min离心15 min，取上清液置入EP管中，待测各脑区组织Cu/Zn-SOD、MDA。MDA含量通过硫代巴比妥酸比色法测定，Cu/Zn-SOD通过黄嘌呤氧化酶法测定。

1.2.4 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件，计量资料以¯x±s表示，结果比较采用t检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组不同脑区脑组织Cu、Zn、Fe含量比较见表1。

表1 两组不同脑区脑组织Cu、Zn、Fe含量比较(μg/g，¯x ± s)

2.2 两组血清Cu/Zn-SOD、MDA比较 见表2。

表2 两组血清Cu/Zn-SOD、MDA比较(¯x±s)

2.3 两组脑组织Cu/Zn-SOD、MDA比较 见表3。

3 讨论

细胞内Cu的稳态对维持机体正常的生理功能具有重要意义。当体内蓄积的Cu超过了组织脏器中各种细胞器含铜蛋白质负载能力时，可对细胞产生毒性，引起膜脂质过氧化、线粒体损伤、溶酶体破裂，继而引起肝脏和神经系统的损害。

表3 两组脑组织Cu/Zn-SOD、MDA比较(¯x±s)

我们前期研究［2］显示，随着喂养时间的延长，Cu负荷模型大鼠肝、脑组织Cu、Zn含量均显著高于对照组，血清ALT和Cu继续增高，肝组织Cu含量也明显增加，提示ALT升高可能与肝Cu沉积对肝细胞功能影响有关。本研究中Cu负荷大鼠脑组织各功能区的Cu含量均明显升高，其中以基底节区、小脑、脑干Cu含量的升高尤为显著，说明当Cu负荷时这些脑功能区可能受损更加明显。

Cu对神经系统的损伤机制尚未完全阐明。目前认为，与氧化应激、金属蛋白/酶功能改变、细胞信号转导机制等有关，而氧化应激是其最重要的机制之一。已有的研究表明，中枢神经元与其他系统不同，在神经细胞膜脂筏中鞘磷脂特别丰富，Cu诱导神经细胞膜的脂质过氧化损伤更重，激发一系列的氧化应激反应［3］。脂质过氧化物分子在生理状态下非常稳定，但当有金属离子存在时，则会产生脂质过氧化反应。而Cu作为参与组成动物机体内几种抗氧化酶与蛋白(Cu/Zn-SOD、MTs)的辅助因子，其作用是催化反应性氧类形成膜脂质过氧化反应。氧自由基生成过多或体内抗氧化物浓度不足是机体发生发生氧化应激的原因所在。

Zn存在于所有生物体中，参与体内多种生理活动，具有广泛的生理功能。在生物体内，Zn对机体抗氧化体系有重要作用，它能防止细胞膜氧化、减少超氧阴离子形成。机体在Zn缺乏时，会导致脂质过氧化加强，诱发机体产生氧化损伤，而补Zn能使该损伤得以恢复［4，5］。Zn能减少铁离子进入细胞，并抵制其在羟自由基引发的链式反应中的催化作用。本研究结果显示，Cu可能通过影响Zn在体内的稳态平衡而可能导致神经元细胞调亡坏死。其机制可能是缺Zn降低Cu/Zn-SOD活力，使机体发生氧化应激，神经细胞变性死亡，最终导致神经变性疾病，而Zn的生理功能较为广泛，亦有可能从其他途径参与神经变性疾病。

Cu/Zn-SOD是机体活性氧清除反应过程中第一个发挥作用的抗氧化酶，对防止氧自由基破坏细胞的组成、结构和功能，保护细胞免受氧化损伤具有重要的作用。研究表明，Cu含量增高时，Cu/Zn-SOD含量下降，脂质过氧化反应增强，氧自由基含量增加，最终导致神经细胞数量减少［6］。本研究结果显示，过量Cu可以导致大鼠血清、大脑基底节区及皮质组织Cu/Zn-SOD活力明显降低。MDA是氧自由基和生物膜不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应的终产物，测定MDA可间接反应机体自由基产生的量和体内脂质过氧化反应的程度［7，8］。本研究中模型组血清及大脑组织中MDA含量明显高于对照组，说明Cu负荷大鼠体内脂质过氧化水平增高，与文献报道［9］基本一致。

综上所述，体内过量Cu会导致血液与组织中Cu/Zn-SOD活力下降及MDA含量增高，使体内自由基蓄积，引起脂氧化，导致肝脏、脑等组织损伤。由于生物体内的氧化应激反应是一个涉及众多环节的复杂病理生理过程，过量Cu及Zn、Fe不足参与神经元细胞氧化应激的具体环节和详细机制有待进一步深入研究。

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