三水白虎汤对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞增殖的蛋白质组学影响

高 燕，肖长虹，潘 超，左芳芳，李凯琴

(南方医科大学中西医结合医院，广州510315)

类风湿关节炎(RA)是临床常见的一种以持续 性滑膜炎和多关节进行性软骨、骨破坏为特点的自身免疫性疾病。三水白虎汤(SSBH)是我院治疗活动期RA的经验方，前期研究结果显示，SSBH含药血清对滑膜成纤维细胞(FLS)增殖具有显著抑制作用，72 h达到高峰［1］。2012年 9～12月，我们利用双向凝胶电泳(2-DE)和质谱技术分析了SSBH含药血清体外培养RA患者的关节FLS蛋白表达图谱，旨在寻找该方抑制FLS增殖的作用靶点，为其治疗RA提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料 SPF级SD雄性大鼠20只，体质量(200±20)g，由南方医科大学实验动物中心提供，许可证号:SCXK(粤)2011-0015。滑膜组织来自南方医院确诊的RA患者的膝关节。SSBH由南方医科大学中西医结合医院中药房提供;DMEM高糖培养液、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶(含 EDTA)(Hy-Clone，美国)，Vimentin单克隆抗体、CD68单克隆抗体(Santa Cruz Biotechnology，inc.)，SP 免疫组化试剂盒(中杉金桥生物技术有限公司)，固相pH梯度干胶条(pH4-7NL，24 cm)、IPG胶条缓冲液购自美国通用公司;尿素、二硫苏糖醇(DTT)、3-［(3-胆酰胺丙基)-二乙铵］-丙磺酸(CHAPS)、十二烷基磺酸钠(SDS)、三羧基氨基甲烷、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、甘氨酸、过硫酸铵、碘代乙酰胺、矿物油、甘油均为美国Sigma公司产品;硫脲为Fluka公司品;其余均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 SSBH含药血清制备及大鼠分组 水煎SSBH 2次，混合2次煎取液进行浓缩，终浓度为含生药2 g/mL。随机将大鼠分为空白对照组(生理盐水组)、SSBH组，每组10只。SSBH组给予2 mL SSBH灌胃，生理盐水组给予等体积的生理盐水，连续给药1周。采血前夜禁食、不禁水，次晨末次给药90 min后腹主动脉采血，3 000 r/min离心10 min，取血清。56℃恒温水浴槽水浴30 min灭活，0.22μm除菌滤膜抽滤除菌后，－20℃保存备用。

1.2.2 滑膜细胞原代培养 将滑膜组织剪成1 mm3大小，均匀排列于培养瓶的培养面，将培养瓶翻转，向瓶中加入适量20%FBS完全培养液，置37℃、5%CO2培养箱培养;孵育4 h待组织块贴附后，将培养瓶缓慢翻转平放，继续静置培养;3～4 d镜下可见组织块周围FLS涡旋状成片生长后，去除组织块后继续培养，待滑膜细胞覆盖培养瓶底面＞80%时，进行消化传代。取传3～6代的FLS，通过免疫细胞化学染色、倒置相差显微镜鉴定合格后备用。

1.2.3 滑膜细胞总蛋白抽提 每1.5×106个滑膜细胞加入100μL细胞裂解液，吹打使细胞与裂解液充分接触，室温放置1 h后，4℃ 40 000 g离心，吸取上清液为细胞总蛋白质，－80℃保存备用。

1.2.4 滑膜细胞总蛋白分离及染色 取蛋白样品与上样缓冲液充分混合加入到水化盘中，用镊子去除预制IPG胶条上的保护层，将胶面朝下置于水化盘样品溶液上。1 h之后加矿物油密封，于室温条件下密封放置16 h。取出胶条吸去多余的液体，将胶条胶面向下放在聚焦槽内，加覆盖矿物油进行第一向等电聚焦电泳。聚焦完毕，取出胶条进行两步平衡15 min。将胶条转移到SDS-PAGE胶上行第二向SDS电泳，低电流(12 mA/gel/17 cm)，待样品在完全走出IPG胶条，浓缩成一条线后，再加大电流(或电压)(24 mA/gel/17 cm)，待溴酚蓝指示剂达到底部边缘约1 cm时即可停止电泳。电泳结束后，取出凝胶采用银染方法进行显色。

1.2.5 图像采集及图谱分析 染色后的凝胶用UMAX PowerLook 1100透射扫描仪获取图像，将扫描后的凝胶放于4℃保存待用。选取在两组图谱中蛋白质表达量相差3倍的点进行分析。

1.2.6 基质辅助激光解析电离飞行时间质谱分析选取差异表达的27个蛋白点，从胶上切下置96孔培养板，经乙腈脱水后，加入适量的胰蛋白酶，37℃酶解12 h，然后加入肽提取液，室温振荡30 min，收集提取液，干燥浓缩备用。将样品和基质充分混合后点样于上样靶，室温干燥后进行图谱采集，将蛋白点的肽质量指纹图谱、分子量和等电点数据输入计算机，使用Mascot搜索引擎进行数据库检索。

2 结果

2.1 FLS的培养鉴定 在倒置显微镜下，所培养的细胞形态符合成纤维细胞的形态特征，呈纺锤状、星形或梭形，部分可呈大多角形。细胞核边界清楚，呈卵圆形，位于细胞的中间，核仁清晰。在FLS培养至第3代时，经镜下观察，具有典型形态特征的树突状细胞，内皮细胞、脂肪细胞、血管内皮细胞基本消失，未见悬浮细胞。传代至第3代及以上时，成纤维细胞样细胞所占比例均＞98%。Vimentin、CD68免疫细胞化学染色结果显示，Vimentin染色阳性，胞质内见大量棕黄色颗粒，CD68染色阴性。

2.2 两组FLS蛋白2-DE图谱及质谱鉴定 SSBH组和NS组FLS蛋白2-DE图谱均出现差异蛋白质点。在差异蛋白表达量超过3倍的蛋白质点中，选取差异表达的27个蛋白点进行PMF分析，成功鉴定出25个点，将这些点经Mascot数据库共鉴定出包括表达上升的IL-1受体拮抗蛋白等共25种蛋白质。见图1。

图1 两组FLS蛋白2-DE图谱

3 讨论

近年研究发现，RA滑膜组织中除了炎性介质IL-1、TNF-α、IL-6、IL-17 等外，还有抗炎型介质如IL-10、IL-1Ra、TGF-β 等，它们可下调炎症反应。因此，RA可被看作是由促炎和抗炎介质不平衡造成的一种疾病。IL-1Ra是IL-1家族中的一员，与IL-1α、IL-1β共同构成了IL-1家族，主要由激活的单核/巨噬细胞产生，包含177个氨基酸残基。IL-1Ra以4种同工蛋白的形式存在，即sIL-1Ra(可溶性IL-1Ra)和 3 种细胞内 IL-1Ra(iIL-1Ral、2、3)［2］。IL-1在RA发病过程中具有非常重要的作用，不仅参与了滑膜炎症和血管翳的形成，而且还在骨与软骨破坏、修复中起重要作用。因此，IL-1Ra通过与IL-1α、IL-1β竞争性结合靶细胞表面的Ⅰ型IL-1R，可以抑制后者的功能，同时IL-1Ra也可以阻断滑膜细胞的PGE2的合成、软骨细胞的胶原产生及软骨基质的降解等，所以IL-1Ra具有抗炎作用，也是迄今发现的惟一天然炎性细胞因子的抑制剂［3］。IL-1Ra与IL-1表达水平之间的平衡影响着RA的发生与发展状态，很可能与IL-1Ra在体液循环时弥散于组织中，影响了IL-1的比率，需要更高浓度的IL-1Ra才有可能抑制IL-1对靶细胞的的生物功能。这样，在局部组织中必须有足够的IL-1Ra才能阻止IL-1的效应。在体外，IL-IRa可封闭 IL-1的效应，降低PGE2和胶原酶的产生，改变它们对蛋白多糖和软骨合成的抑制［4］。

SSBH为临床自拟验方，以《千金药方》犀角散和《广济总录》白虎汤化裁而成，具有清热除湿、祛风通络、活血止痛的功效。本课题组前期［1］研究结果显示，在设定的10% ～50%5个浓度含药血清中，20% ～30%含药血清抑制FLS增殖效应最大。SSBH含药血清作用于FLS 48 h后即表现出对细胞增殖的显著抑制作用，72 h达到高峰。各项研究提示，SSBH可能具有抗炎镇痛、调节免疫、阻断软骨和骨质侵蚀等多种药理作用［5］，其作用机制包括:抑制基质金属蛋白酶、NF-κB在关节局部的表达;抑制TNF-α的产生;抑制FLS内P38MAPK的激活［6］。

蛋白质组学技术的应用为RA的研究提供了一个新的平台。国内外学者应用2-DE和质谱技术对RA患者血浆、滑膜组织、滑膜细胞的蛋白质表达进行了研究，发现了多种在RA中特异表达的蛋白质［7～9］。因此，本实验采用20%含药血清培养72 h后达最大抑制细胞增殖效应的滑膜细胞进行细胞总蛋白的抽提，利用2-DE和质谱技术分析SSBH含药血清体外培养的RA患者FLS蛋白表达图谱，通过对生理盐水组的表达差异进行分析，寻找该方在最佳作用浓度和时间下抑制滑膜细胞增殖的作用靶点。结果显示，RA FLS中IL-1Ra蛋白的表达较正常组比较明显上升，提示SSBH可能通过上调IL-1Ra的表达，IL-1Ra竞争性抑制IL-1的效应，从而起到抑制FLS增殖的作用，这可能是SSBH治疗RA的药理机制之一，但是该蛋白的功能还需进一步进行验证，要具体阐明SSBH药理作用还有待更进一步的研究。

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