人外周血单核细胞经体外诱导向淋巴管内皮细胞分化的实验研究

李 鑫，梁艳红，韩学锋，邵 英，丁海玲，张立平

(1淄博市中心医院，山东淄博255000;2山东英才学院;3山东省邮政公司门诊部;4山东杏林科技职业学院)

内皮祖细胞(EPCs)在参与成体血管新生及创伤修复和缺血性疾病治疗等方面发挥着重要作用［1］，但由于EPCs含量极少，其应用受到限制。近年研究发现，人外周血单核细胞也具有多向分化潜能［2］，与淋巴管新生有密切联系［3］，且其数量相对较多，取材较为方便。基于此，2009年10月～2012年7月，我们观察了人外周血单核细胞经体外诱导向淋巴管内皮细胞分化的可能性。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 主要试剂:胎牛血清(FBS)，Hyclone公司;人淋巴细胞分离液(Ficoll)，天津市灝阳生物制品科技有限公司;内皮细胞生长培养基EGM-2，Lonza公司;L-DMEM培养基，Gibco公司，人纤维连接蛋白(FN)，Sigma公司;一抗:兔抗人LYVE-1单克隆抗体、兔抗人 Podoplanin单克隆抗体、兔抗人VEGFR-3单克隆抗体、兔抗人vWF单克隆抗体、兔抗人VEGFR-2单克隆抗体，北京博奥森生物技术有限公司;二抗:FITC标记羊抗兔多克隆二抗、TRITC标记羊抗兔多克隆二抗，北京中杉金桥生物技术有限公司;Trition-X 100，北京索来宝科技有限公司;DAPI荧光染液，碧云天生物技术研究所;Trizol试剂，Inventrogen公司;Revert Aid First Strand cDNA Synthesis试剂盒，Fermentas公司;DNA Marker和2×EasyTaq PCR SuperMix，北京全式金生物技术公司;EB，Sigma公司;PE标记的CD14抗体、FITC标记的CD14抗体、PE标记的 CD34抗体、Alexa Fluor647标记的Podoplanin抗体、PE标记的VEGFR-3抗体、FITC标记的LYVE-1抗体，Biolegend公司。主要仪器:Olympus IX70荧光显微镜，Olympus公司;PCR仪，Whatman Biometra公司;FC500型流式细胞仪，BECKMEN-KULTER公司。

1.2 方法

1.2.1 单核细胞的分离与培养 采集健康志愿者外周血100 mL(柠檬酸钠抗凝)，用Ficoll密度梯度离心法分离获取单个核细胞，PBS液洗涤2次，用含15%人血清的内皮细胞培养基EGM-2重悬。EGM-2含有基础培养基 EBM和添加物 hFGF、VEGF、R3-IGF-1、ascorbic acid、hEGF、GA-100、heparin和hydrocortisone。调整细胞密度至1×106/mL，接种于用20 ng/mL FN铺板的6孔板，37℃、5%CO2条件下培养，2 d后收集未贴壁细胞，接种至另一FN铺板的6孔板中诱导培养，每3 d换液1次。

1.2.2 VEGFR-3、Podoplanin、LYVE-1、VEGFR-2、vWF的表达检测 采用荧光免疫细胞化学染色法。取诱导培养7 d的细胞进行免疫荧光染色。用DAPI复染细胞核，于倒置荧光显微镜下观察细胞。细胞呈红色或绿色、细胞核呈蓝色为阳性。

1.2.3 Podoplanin、Prox-1、VEGFR-3、LYVE-1、vWF的基因表达检测 采用RT-PCR法。取诱导培养7 d的细胞提取细胞总RNA。取500 ng RNA进行反转录，用Prime Script RT试剂盒在下列条件下合成cDNA:65 ℃ 5 min，25 ℃ 5 min，42 ℃ 60 min，70 ℃5 min。取1μL cDNA作模板，依次加入dH2O 10.5 μL，2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，上游和下游引物各0.5μL进行扩增，反应条件为:94℃预变性3 min，94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35～38个循环，最后72℃延伸5 min。PCR产物于2%琼脂糖凝胶电泳检测。用β-actin做内参。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司设计合成。PCR引物序列:LYVE-1:上游引物:5'-TTCCATCCAGGTGTCATGCAG-3'，下游引物:5-AAGGGGATGCCACCGAGTAG-3';VEGFR-3:上游引物:5'-AAGTACATCAAGGCACGCATC-3'，下游引物:5'-GCAGTTCAGGACCAGCTTCT-3';VEGFR-2:上游引物:5'-CCGTCAAGGGAAAGACTACG-3'，下游引物:5'-CTTTACCCCAGGATATGGAG-3';Podoplanin:上游引物:5'-GCCAGCCAGAAGATGACACTG-3'，下游引物:5'-GAATGCCTGTTACACTGTTGACAC-3';Prox-1:上游引物:5'-CACCTGAGCCACCACCCTTG-3'，下游引物:5'-GCATTGCACTTCCCGAATAAGGT-3';vWF:上游引物:5'-CACCGTTTGCCCACCCTTCG-3'，下游引物:5'-GCCCACTGGGAGCCGACACT-3';β-actin:上游引物:5'-CCATCTACGAGGGGTATGCCC-3'，下游引物:5'-TCCTTAATGTCACGCACGATTTCC-3'。

1.2.4 淋巴管内皮细胞标志物表达检测 采用流式细胞术。取新鲜分离的单核细胞，调整细胞密度至1×107/mL，分别加入PE标记的VEGFR-3抗体和FITC标记的CD14抗体，4℃孵育40 min，PBS液洗涤2次，离心后弃上清，加入适量PBS重悬混匀后，上流式细胞仪检测。取诱导培养7 d的细胞，加入2%利多卡因，37℃孵育5～8 min后吹打成细胞悬液，调整细胞密度至1×107/mL，加入PE标记的VEGFR-3抗体，按照上述步骤孵育重悬后上流式细胞仪检测。各组均以同型抗体作为阴性对照。

2 结果

2.1 细胞形态学改变 新鲜分离的单个核细胞呈小圆形，经FN铺板、EGM-2贴壁培养2 d后细胞开始变大，部分细胞伸出小的突起或呈椭圆形。7 d时细胞伸长，呈纺锤形或多角形(如图1A)。诱导培养 7 d的细胞对 LYVE-1、Podoplanin、VEGFR-3、VEGFR-2及vWF的表达均为阳性(如图1B～F)。

图1 细胞形态学改变注:A:培养7 d的细胞形态，呈纺锤形或多角形(EGM-2培养，×200);B～E:免疫荧光细胞化学染色，B:VEGFR-3(FITC染色，×200)，C:LYVE-1(TRITC染色，×200)，D:Podoplanin(TRITC染色，×200)，E:vWF(FITC染色，×200)，F:VEGFR-2(FITC染色，×200)

2.2 RT-PCR检测结果 PCR扩增后电泳结果示，经诱导培养7 d的EPCs对Podoplanin、Prox-1、VEGFR-3、LYVE-1、vWF的基因表达均为阳性，而对VEGFR-2的基因表达不恒定，呈弱阳性或阴性。见图2。

2.3 流式细胞术检测结果 新鲜分离的单核细胞经流式双标检测对淋巴管内皮细胞标志物的表达如下:VEGFR-3为0.1%，培养7 d后的EPCs对VEGFR-3的表达率为26.9%。见图3。

3 讨论

图2 培养7 d的单核细胞对淋巴管内皮标志物和内皮共同标志物的mRNA表达情况注:A:VEGFR-3(417 kb)，B:Podoplanin(200 kb)，C:Prox-1(200 kb)，D:LYVE-1(434 kb)，E:vWF(435 kb)，F:β-actin(200 kb);Marker 7 条带依次为100、200、300、400、500、600 和700 kb

图3 VEGFR-3的流式细胞术检测图

近年研究发现，单核细胞具有多分化的潜能，经特定因子定向诱导，能转分化为T细胞、上皮细胞、成骨细胞、肌细胞、肝细胞等［4］。因此，许多学者对单核细胞进行体外诱导培养，使其转分化为EPCs，并进一步分化成血管内皮细胞［5，6］。人外周血中的单核细胞来源丰富且取材方便，如果能作为淋巴管内皮细胞的来源，并用于临床淋巴水肿的治疗，将有很好的应用前景。

淋巴管内皮标志物Prox-1、LYVE-1、Podoplanin、VEGFR-3是淋巴管内皮细胞的分子生物学特性，对淋巴管内皮功能的发挥、淋巴管的新生等具有重要作用。其中，Pox-1对淋巴管内皮细胞的定型及发育起重要作用［7］;LYVE-1在蛋白和基因水平特异性表达于淋巴管内皮［8］;Podoplanin作为一种跨膜糖蛋白，在淋巴管内皮特异性表达［9］，VEGFR-3是诱导淋巴管新生的关键蛋白［10］。本课题组以往的研究发现，许多炎症细胞因子短期刺激单核细胞即能表达淋巴管内皮标志物Prox-1和Podoplanin［11］。然而，单核细胞经过诱导刺激能否进一步分化成淋巴管内皮细胞尚有待研究。本研究在此基础上，经体外诱导培养后，检测了其对淋巴管内皮标志物VEGFR-3、Podoplanin、LYVE-1、Prox-1 和内皮共同标志物vWF、VEGFR-2的表达情况。结果发现，经体外诱导培养7 d时，单核细胞表达所有的淋巴管内皮标志物，使其向淋巴管内皮细胞的分化成为可能。对内皮细胞共同标志物vWF表达阳性，对VEGFR-2 mRNA的表达则不稳定，呈弱阳性或阴性。单核细胞来源的EPCs表现低增殖能力可能与低表达VEGFR-2 有关［12］。

综上所述，人外周血单核细胞来源的EPCs经体外诱导培养后可以表达淋巴管内皮细胞标志物，但表达部分内皮共同标志物，特别是对VEGFR-2的表达为弱阳性或阴性，还不能称之为真正的淋巴管内皮细胞，需要进一步的研究。

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