五步蛇毒抗凝血作用机制的研究

余 雷，何华晋，唐榕英，宁 宗

(1广西医科大学第一附属医院，南宁530021;2柳州市工人医院;3广西医科大学研究生院)

五步蛇又称尖吻蝮，在我国主要分布在长江流域及其以南地区，山区较为多见［1］。五步蛇伤病例在临床上很常见，因其咬伤与弥散性血管内凝血(DIC)有类似的临床表现，多年来一直被认为是引起DIC的病因之一［2］。近年来，Isbisterd等指出五步蛇咬伤引起的临床表现是蛇毒诱导的消耗性凝血障碍(Venom-induced consumption coagulopathy，VICC)［3，4］。本实验通过建立大鼠五步蛇毒中毒模型，检测大鼠凝血功能、凝血因子(Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ)活性及部分血常规指标，并于光镜下观察了肺脏微循环改变，旨在探讨五步蛇咬伤所致凝血功能障碍的发生机制。

1 材料与方法

1．1 动物及试剂 健康清洁级 Sprague-Dawley(SD)大鼠30只，雌雄各半，体质量180～200 g(合格证:SCXK桂2010-2011)，由广西医科大学实验动物中心提供;五步蛇毒白色冻干粉(批号100228)，江西鹰潭蛇场广州办事处提供。

1．2 动物分组及模型制作 参考黄松等［4］文献，将五步蛇毒白色冻干粉与0．9%氯化钠注射液按5∶1(每5 mg五步蛇毒溶于1 mL生理盐水中)配成蛇毒溶液。将30只SD大鼠随机分为实验组和对照组各15只，分别予0．35 mL蛇毒溶液及等量生理盐水腹腔内注射，其后均常规喂养。

1．3 观察指标及标本采集 腹腔注射药物24 h内观察大鼠的行为表现，包括精神状态、活动、进食、呼吸频率、对刺激的反应等。24 h后，10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠(300 mg/kg)，麻醉成功后立即沿腹正中线切开暴露腹腔，经腹主动脉采血4．0 mL(其中2．0 mL注入EDTA抗凝管，余2．0 mL注入枸橼酸钠抗凝管)，立即送广西医科大学第一附属医院检验科检查凝血功能指标PT、纤维蛋白原(Fg)、凝血因子(Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ)活性及血常规指标 WBC、RBC、Hb、PLT;迅速切开胸腔，观察胸腹腔各脏器的形态学变化;剪取大鼠右上肺叶，放入10%甲醛溶液中固定，石蜡包埋固定后切片，HE染色后送广西医科大学第一附属医院病理科，光镜下观察肺脏微血管内有无微血栓形成。

1．4 统计学方法 采用SPSS16．0统计软件。计量资料以¯x±s表示，组间比较采用t检验。P≤0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 两组行为表现及解剖发现 ①行为表现:腹腔注射药物30 min后两组均未出现死亡，实验组均出现不同程度的懒动、嗜睡、呼吸深快、反应迟钝、步态不稳、拖步等表现，对照组无明显异常。②解剖发现:24 h后实验组腹腔注射部位周围皮下均可见大小不等的瘀斑，未见局部组织坏死，腹腔内有较多不凝血液，胃、肠及肠系膜表面可见散在出血点，胸腔内未发现积血;对照组无明显异常。

2．2 两组血常规指标及凝血功能指标比较 与对照组比较，24 h后实验组PLT计数明显减少(P＜0．05)、WBC 计数明显增高(P ＜0．05)，RBC 计数及Hb均无明显变化(P均＞0．05)，详见表1;实验组血清Fg明显下降(P＜0．05)，PT和凝血因子Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ活性无明显变化(P均＞0．05)，详见表2。

2．3 两组肺脏组织光镜下表现 对照组肺泡及支气管结构清晰，肺泡壁内毛细血管、小血管清晰可辨，毛细血管内红细胞多为1～2个，未见微血栓，肺泡腔未见渗出(见图1，A、B图均为200×)。实验组肺泡及支气管结构清晰，肺泡壁内毛细血管、小血管清晰可辨，肺泡间隔稍增厚，少数毛细血管内红细胞超过2个，部分肺泡上皮及血管内皮细胞轻度肿胀，未见微血栓，肺泡腔亦未见渗出(见图2，C图为100×，D图为400×)。

表1 两组 RBC、Hb、PLT 比较(n=15±s)

表1 两组 RBC、Hb、PLT 比较(n=15±s)

组别 RBC(×109/L) Hb(g/L) WBC(×109/L)PLT(×109/L)实验组 6．31 ±0．25 138．40 ±4．86 10．22 ±0．81 14．48 ± 7．99对照组 6．44 ±0．37 139．00 ±3．39 6．13 ±1．08 938．20 ±188．99

表2 两组PT、Fg及凝血因子Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ活性比较(n=15 ± s)

表2 两组PT、Fg及凝血因子Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ活性比较(n=15 ± s)

组别 PT(s)Fg(g/L)凝血因子Ⅷ(%)凝血因子Ⅸ(%)凝血因子Ⅺ(%)实验组 9．40 ±0．46 0．64 ±0．19 231．56 ±3．24 40．24 ±1．76 50．80 ±2．59对照组 9．40 ±0．46 2．63 ±0．11 231．04 ±5．25 40．88 ±4．33 50．49 ±3．09

图1 对照组大鼠光镜下肺脏组织表现

图2 实验组大鼠光镜下肺脏组织表现

3 讨论

五步蛇咬伤病例临床上很常见，国内外近年来有报道指出，蛇咬伤并非一定引起DIC，而可能是“非典型DIC”或者“VICC”。关于蛇咬伤患者合并微血管病变而非出现急性DIC的报道，可能是因为部分此类患者的症状能在治疗数周后缓解而无明显后遗症［7］，与急性DIC的恶性进展不一致。由于临床诊断的局限性，上述结论多半是通过临床表现与临床实验室检查结果推测得出，并未有微循环的病理学依据。本研究显示，腹腔注射药物30 min后两组均未出现死亡，实验组均出现不同程度的懒动、嗜睡、呼吸深快、反应迟钝、步态不稳、拖步等表现;注药24 h后实验组腹腔注射部位周围皮下均可见大小不等的瘀斑，未见局部组织坏死，腹腔内有较多不凝血液，胃、肠及肠系膜表面可见散在出血点，胸腔内未发现积血。提示实验组均出现一定中毒症状，且有急性出血表现。但本研究中肺组织HE染色发现，实验组肺泡及支气管结构清晰，肺泡壁内毛细血管、小血管清晰可辨，肺泡间隔稍增厚，少数毛细血管内红细胞超过2个，部分肺泡上皮及血管内皮细胞轻度肿胀，未见微血栓，肺泡腔亦未见渗出。初步推测五步蛇毒并未导致大鼠的微循环功能障碍，其通过内、外源性凝血系统引起大鼠发生DIC的可能性不大。可能只是一种消耗性凝血功能障碍，即VICC状态。当然，该实验不能排除染毒大鼠肺脏内曾有微血栓形成但被继发亢进的纤溶系统清除或其他终末器官内有微血栓形成的可能;另一种可能是和模型建立使用的中毒剂量有关。临床上亦有用五步蛇毒类凝血酶来抗血栓［8］，在治疗量或者过量情况下也引起凝血功能障碍，但未见有发生DIC的报道，此与本研究结论一致。

本研究还显示，与对照组比较，实验组PLT计数明显减少、WBC计数明显增高，RBC计数及Hb均无明显变化;实验组血清Fg明显下降，PT和凝血因子Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ活性无明显变化。提示:①蛇毒可能直接消耗体内的PLT，阻止血小板性血栓形成;蛇毒中的类凝血酶成分能直接作用于Fg，裂解其血纤肽A，产生不交联蛋白，此蛋白很快可被机体网状内皮系统吞噬和被循环血液清除;此外，蛇毒中的纤溶成分能直接溶解纤维蛋白，进一步导致Fg消耗。②实验组WBC增高可能与中毒、机体出血引起的应激反应有关;RBC、Hb未见明显下降，而大鼠腹腔内及多个脏器均发现有出血的原因，可能是五步蛇毒引起的损伤属于急性出血(未直接引起溶血和广泛性红细胞性血栓形成)及急性中毒反应所致血液浓缩。PT和凝血因子Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ无明显变化的原因考虑可能是染毒24 h内经历了凝血因子消耗、再恢复的过程;五步蛇毒或许对凝血因子无明显影响。

综上所述，五步蛇毒所致机体以出血为主的特征性改变属于机体消耗性凝血功能障碍。

［1］张启宇．内科手册［M］．南京:江苏科学技术出版社，2007:1577．

［2］ Levi M．Disseminated intravascular coagulation［M］．Crit Care Med，2007:2191-2195．

［3］Isbister GK，Little M，Cull G，et al．Thrombotic microangiopathy from Australian brown snake(Pseudonaja)envenoming［J］．Intern Med，2007，37(8):523-528．

［4］黄松，黄接棠．乌梢蛇血清的抗出血因子:一个有前途的抗蛇毒药物原料(英文)［J］．动物学报，2006，52(6):1113-1118．

［5］Isbister GK，Duffull SB，Brown SG．Failure of antivenom to improve recovery in Australian snakebite coagulopathy［J］．QJM，2009，2(8):563-568．

［6］宁宗，李其斌．广西竹叶青蛇咬伤后血液学动态变化及发生非典型 DIC 的观察分析［J］．中国急救医学，2010，30(9):835-837．

［7］Isbister GK．Snakebite doesn't cause disseminated intravascular coagulation:coagulopathy and thrombotic microangiopathy in snake envenoming［J］．Semin Thromb Hemost，2010，36(4):444-451．

［8］欧光武，李威．尖吻蝮蛇类凝血酶的研究现状［J］．中国医药导报，2010，7(12):9-11．