肺通口服液对大鼠急性肺损伤的治疗作用及其机制

张 欣，王丁丁，牟 洁

(1青岛大学医学院附属医院，山东青岛266003;2济南市第四人民医院;3山东医学高等专科学校药学系)

急性肺损伤(ALI)以大量活化的中性粒细胞(PMN)在肺血管和间质聚集为病理特征，活化的PMN释放中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)，损伤毛细血管内皮细胞和肺泡上皮细胞，消化和降解细胞外基质及上皮连接结构，参与和启动 ALI的发生［1］。本研究观察了肺通口服液对ALI大鼠血清中NE含量的影响，旨在探讨其对ALI的治疗作用及机制。

1材料与方法

1．1 材料 40只雄性SD大鼠，体质量180～200 mg，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供;博来霉素(8 mg/支)购自天津太和制药有限公司;氢化考的松(25 mg/支)购自天津生物化学制药厂;肺通口服液(20 mL/支)购自济南宏济堂制药有限公司;Anti-Elastase NE抗体IgG试剂盒96T购于德国BL公司。

1．2 实验方法

1．2．1 动物分组及处理 取40只雄性SD大鼠，随机分为模型组、治疗组、激素组、正常对照组各10只。①模型组:采用BLEMA5法制备肺间质纤维化模型。用2%戊巴比妥钠30 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，以仰卧位固定在鼠板上，固定四肢、头部，用开鼻器撬开口腔后将舌轻轻拉出，压迫舌腹，暴露喉头，在额镜注视下，在大鼠吸气瞬间迅速将与1 mL注射器相连的钝头9号腰穿针插入气管，约达气管分叉处，缓慢注入5 mg/kg平阳霉素(用生理盐水0．5 mL/mg溶解)和0．5 mL空气，其后立即将动物直立旋转，使药物在肺内分布均匀(如发生窒息，立即进行人工心脏按摩)，动物清醒后常规饲养28 d。②治疗组:按模型组方法一次性气管内注入平阳霉素，24 h后每日予肺通口服液250 mg/kg(用生理盐水溶解后2～4 mL/只)灌胃1次，共28 d。③激素组:按模型组方法一次性气管内注入平阳霉素，24 h后每日肌注氢化考的松25 mg/kg，共28 d。④正常对照组:按模型组处理，仅将气管内注入药物改为生理盐水2 mL/kg，常规饲养28 d。

1．2．2 标本取材 各组于实验14、28 d分别经左侧颈内静脉抽取静脉血2 mL，其后经腹主动脉放血处死，立即开胸取右肺中叶，置于4%多聚甲醛/0．1 PBS(pH 值7．0～7．4)中，以含 1/1 000 DEPC 的固定液固定1 h，常规脱水、浸蜡、包埋，切片厚度为6～8μm。

1．2．3 肺组织形态学观察 ①大体所见。②HE染色:按Szapie方法确定肺泡炎和肺间质纤维化程度。肺泡炎分为四级，其中0级指无肺泡炎(－);1级指轻度肺泡炎(+)，受累面积＜全肺20%;2级指中度肺泡炎(++)，受累面积占20% ～50%;3级指中度肺泡炎(+++)，受累面积＞50%。肺间质纤维化分为四级，其中0级指无肺间质纤维化(－);1级指轻度肺间质纤维化(+)，病变范围局限在全肺20%以下;2级指中度肺间质纤维化(++)，病变范围占全肺20% ～50%;3级指重度肺间质纤维化(+++)，病变范围＞50%，肺泡融和，肺实质结构紊乱。③VG染色:观察肺泡胶原沉积和纤维化情况。

1．2．4 血清NE含量检测 取实验14、28 d抽取的静脉血，静置15 min，4℃下3 000 r/min离心15 min，离心半径15 cm，收集血清，40℃保存。用ELISA法测定血清NE含量。

1．3 统计学方法 采用SPSS13．0统计软件。计量数据用±s表示，各组样本均数的比较采用方差分析。P≤0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 各组肺组织形态学变化 ①大体所见:正常对照组双肺外观无异常，表面光滑、饱满，呈粉红色;模型组表面凹凸不平，多呈暗红色，边缘有点状出血，部分肺叶体积缩小、呈灰白色、表面有白色结节;治疗组与正常对照组相似，部分肺叶呈暗红色;激素组与模型组相似，部分肺叶表面光滑。②HE染色:正常对照组肺泡及间隔结构正常;模型组可见肺泡结构破坏，灶性纤维化形成，分布不均，肺泡间隔增厚，部分肺泡腔缩小甚至消失，肺实质结构紊乱，部分局部炎细胞浸润;治疗组可见肺泡间隔增厚程度减轻，炎性细胞较少，肺泡结构基本正常;激素组肺泡炎及纤维化减轻不甚明显。模型组肺泡炎以1、2级为主，肺间质纤维化以2、3级为主;治疗组肺泡炎及肺间质纤维化均为0级或1级;激素组肺泡炎主要为1级，肺间质纤维化以1、2级为主。③VG染色:正常对照组肺泡结构正常，偶见胶原纤维;模型组肺实质结构紊乱，可见肺间质大量红色胶原纤维沉积，肺泡腔缩小;治疗组胶原纤维较少，肺实质结构基本正常;激素组可见不同程度的胶原纤维沉积。

2．2 各组血清NE含量比较 模型组和激素组第14、28天血清NE含量较正常对照组显著增高(P均＜0．01);治疗组第14、28天血清 NE含量较模型组和激素组显著降低(P均＜0．01)，详见表1。

表1 各组大鼠血清NE含量比较［ρ/(μg·mL)±s］

表1 各组大鼠血清NE含量比较［ρ/(μg·mL)±s］

注:与正常对照组相比，*P＜0．01;与模型组和激素组相比，△P＜0．01

组别 n NE 14 d 28 d模型组 10 12．91 ±2．78* 17．09 ±6．99*10 3．98 ±1．34 4．60 ±2．67激素组 10 12．66 ±2．95* 20．57 ±4．74*治疗组 10 3．88±2．01△ 3．01±1．65△正常对照组

3 讨论

ALI是全身失控性炎症反应的肺部表现，其中激活的PMN在肺内聚集是导致肺损伤发生、发展的重要步骤［2，3］。肺间质纤维化的病理特征是大量活化的PMN在肺血管和问质聚集，活化的PMN释放NE和氧自由基［2］，而NE可通过水解肺弹性蛋白、蛋白多糖和胶原直接损伤肺血管内皮细胞和血管基底膜，并有可能是全身炎症反应综合征(Systemic inflammatory response syndrome，SIRS)时各种原因导致肺间质纤维化的共同通路［1，4］。NE 由 PMN 合成、储存和释放，又可反馈性调控PMN的生成、游走和浸润，两者之间形成负反馈调节网络［5］。NE是一种蛋白溶解酶，作用底物十分广泛，包括细胞外基质成分和多种可溶性蛋白［4，6］。NE的最适底物是弹性蛋白，弹性蛋白被分解时，上皮及内皮细胞间的紧密连接被破坏，毛细血管通透性增加，大量血浆成分和活性物质渗透至肺间质，使肺水肿形成［4，6］。NE还可诱导细胞因子粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF)、IL-6、IL-8等的表达，趋化并激活更多的PMN［7］，使肺部炎症反应和肺损伤不断放大。

目前研究认为，NE在ALI成人呼吸窘迫综合征(ALIYARDS)发病中起着十分关键的作用［8］，减少NE释放和降低NE活性是药物治疗ALI的有效途径。有研究表明使用蛋白酶抑制剂可明显降低NE活性，减轻缺血/再灌注后肺损伤［9］。肺通口服液是以益气养阴、清热化痰、止咳化痰为治则，由黄芪、党参、麦冬、沙参、当归等组方的中成药物。本研究显示，正常对照组双肺外观无异常，HE、VG染色所示肺组织学形态亦正常，模型组肺组织均出现出血及坏死(提示制模成功)，激素组肺泡炎和肺间质纤维化程度与模型组相似，治疗组肺泡炎和肺间质纤维化程度与激素组和模型组相比显著减轻;治疗组第14、28天血清NE含量较模型组和激素组显著降低。提示肺通口服液能减轻内毒素所致肺间质纤维化大鼠的肺组织损伤，机制可能与其降低血清中NE表达、降低肺泡毛细血管通透性、减轻肺水肿有关。

综上所述，肺通口服液能减轻ALI大鼠的肺泡炎和肺间质纤维化程度，可能机制是通过减少血清NE释放降低肺泡毛细血管通透性、减轻肺水肿。

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