乳腺癌患者外周血miR-155水平与远处转移的相关性

李永宪，纪术峰

(1郑州市第九人民医院，郑州450053;2南方医科大学珠江医院)

乳腺癌是我国女性发病率最高的恶性肿瘤，每年因乳腺癌死亡的妇女达1．3万例［1］。长期以来，人们对乳腺癌肿瘤标志物的研究非常重视。微小RNA(miR)是一类内源性非编码RNA，长度为20～22 bp，广泛存在于真核生物细胞中，具有调控细胞分化、发育、增殖的作用，对肿瘤的发生、发展起重要作用。以往细胞的自分泌、旁分泌多指某些信号蛋白分子的分泌;近期研究显示，细胞还可分泌小分子核酸，即循环 miR［2，3］。本研究比较了 miR-155 在转移乳腺癌与非转移乳腺癌患者血清中的表达，并分析乳腺组织中其靶标原钙黏蛋白9(PCDH92)的表达，以探讨miR-155对乳腺癌转移的预测价值。

1 资料与方法

1．1 临床资料 选择珠江医院、郑州市第九人民医院2009年1月～2012年5月收治的乳腺癌患者40例，均为女性，年龄27～72岁、中位年龄52．3岁。均经病理检查确诊。其中伴远处转移(包括肺、肝、骨等)20例(转移组)，仅有原发病灶20例(非转移组)。

1．2 方法

1．2．1 实时荧光定量PCR(QRT-PCR)检测 收集手术或穿刺获得的乳腺癌组织液氮冻存，分离血常规检测后剩余标本的血浆－80℃保存。按mirVanaTMPARISTM试剂盒(美国Applied Biosystem公司产品)说明书的方法抽提血浆和乳腺癌组织的总RNA。取 1μL RNA在NanoDropND-1000 Spectro photometer仪(美国NanoDrop公司)上测定RNA浓度。抽提获得的RNA置于－80℃保存备用，或直接检测。使用miR-155的QRT-PCR检测试剂盒(上海吉玛公司)检测血浆miR-155的水平，以U6为内参对照。PCDH9引物:上游引物:5'-TTTAGGAGAAACTACCTTGTGC-3'，下 游 引 物:5'-TGAGCATTAAAGTCACTTGAGG-3'，使用 QRT-PCR试剂盒(Takara公司)检测乳腺癌组织中PCDH9 mRNA水平，以GAPDH为内参对照。cDNA反转录反应条件:37℃ 1 h，95℃ 5 min。PCR反应条件:95℃预热15 min;94 ℃ 15 s、55 ℃ 30 s、70 ℃ 34 s，共40 个循环。实验重复3次。miR-155及PCDH9的表达水平均以正常人乳腺上皮细胞MCF-10A为对照，数据采用 2－ΔΔCT法进行分析。

1．2．2 统计学方法 采用SPSS16．0统计软件，结果以¯x±s表示，组间比较采用Oneway方差分析。P≤0．05为差异有统计学意义。

2结果

2．1 两组血浆miR-155水平比较 QRT-PCR检测结果显示，转移组血浆miR-155水平远高于非转移组(P ＜0．01)。见图1。

2．2 两组miR-155靶标预测 Targetscan软件预测miR-155可以与PCDH9基因3'-UTR上8mer种子序列“AGCAUUAA”(459～466 bp)的碱基互补结合。

2．3 两组乳腺癌组织中PCDH9基因表达比较QRT-PCR检测结果显示，转移组乳腺癌组织中PCDH9 mRNA水平远低于非转移组(P＜0．05)。见图2。

图1 两组血浆miR-155水平

图2 两组乳腺癌组织中PCDH9 mRNA表达

3 讨论

miR仅占人类基因总数的1%左右，却调控着30%以上的编码基因表达。由于存在高度组织特异性和实效特异性，miR对多种疾病的诊断、分类、分期及预后判定具有重要意义。2008年，Mitchell等从正常人血浆中分离出18～24个碱基的RNA片段，使用5'和3'RNA-RNA接头连接，接着应用RTPCR扩增，形成小RNA的cDNA库，其中93%对应已知的miR。后期的诸多研究也显示，miR的信号传递方式是双通道或多通道的，即当细胞受到刺激后，能够选择性地把miR包裹进细胞内的微小颗粒内，并分泌到循环血液中。特定的生理与病理生理条件下，细胞可一次性分泌多种miR，从而调节靶细胞中多个基因的表达翻译。成熟miR可长期稳定存在于循环体液中，RNA酶的降解、煮沸、反复冻融、酸碱环境等都不会造成循环miR的损失，影响其长期保存，故动态监测miR是理想的肿瘤诊断、治疗和预后判断的新标志物。

miR具有高度的组织时效性，BIC基因上具有一段138个核苷酸的保守序列，即编码miR-155的发夹结构，在Burkitt淋巴瘤等肿瘤中显著高表达。Cai等［4］研究显示，miR-155在结肠癌细胞中高表达，并通过靶向抑制肿瘤抑制因子CHD5在体内外抑制瘤细胞的增殖。Wang等［5］研究表明，miR-155在人肝癌细胞中的表达较正常细胞高。miR-155高表达也是口腔癌预后差的标志之一［6］。但miR-155在黑色素瘤细胞株［7］及病理瘤组织内低表达，过表达miR-155则可显著抑制瘤细胞集落形成，并可通过调节POU3F2、MITF基因表达抑制黑色素瘤细胞的侵袭迁移能力［8］。本研究检测了伴有转移和仅有原发病灶乳腺癌患者的血浆miR-155水平，结果显示，转移患者血浆miR-155水平明显升高。进一步通过Targetscan软件预测，发现miR-155可与其靶标PCDH9的3'-UTR上1个8mer的保守位点结合。原钙黏蛋白是钙黏蛋白超家族中最大的一个亚家族，该家族成员均具有胞外结构、质膜区及胞内区三部分。Wang等［9］研究显示，PCDH9在正常脑组织中呈强阳性表达，但在原发性脑胶质细胞瘤样本表达下调，阳性率约为51．7%，且组织学分级越高，表达下调越显著，进一步分析PCDH表达与患者5年生存的相关性，结果显示PCDH9阴性者的预后明显差于阳性者。本研究应用QRT-PCR法检测了乳腺癌肿瘤组织中PCDH9的表达，结果显示，有转移的乳腺肿瘤组织内PCDH9 mRNA水平远低于仅有原发病灶的肿瘤组织，也提示PCDH9低表达患者预后较差。

综上所述，循环miR-155可作为乳腺癌转移预测的分子标志物，该方法具有创伤小、方法简便、便捷的优势，在乳腺癌早期诊断、治疗、预后判断方面有着广阔的应用前景。

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