HPV16感染与宫颈病变组织HDAC1和P21waf表达的关系

苗立业，邢 军，李秀伟

(1 河北联合大学，河北唐山 063000;2 河北联合大学附属医院)

研究表明，高危型人乳头瘤病毒(HPV)感染是宫颈上皮内瘤样病变(CIN)和宫颈癌的主要致病因素，宫颈鳞癌患者HPV16感染较为多见［1］。组蛋白去乙酰化酶1(HDAC1)是表观遗传调控中的关键酶，能够介导核小体的结构改变和调节基因表达，参与细胞周期的进程和分化。细胞周期调控抑癌基因P21waf作为细胞周期素依赖性激酶抑制因子之一，可通过调节细胞周期进程参与细胞的生长、增殖、分化和衰老。2008年6月～2011年6月，我们对不同病变宫颈组织中HPV16感染情况及其与HDAC1和P21waf的关系进行了研究。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择华北煤炭医学院附属医院病理科2008年6月～2011年6月存档的宫颈病变组织蜡块110份，取样时患者年龄25～72岁、中位年龄44.5岁。取样前均未经放疗和化疗。均由病理科医师诊断及确定组织学分级，其中慢性宫颈炎20份(宫颈炎组);CIN 70份，包括CINⅠ22份(CINⅠ组)、CINⅡ24份(CINⅡ组)、CINⅢ24份(CINⅢ组);宫颈癌20份(宫颈癌组)。主要试剂:HDAC1兔抗体人多克隆抗体购于北京博奥森生物技术有限公司;P21waf鼠抗人单克隆抗体购于北京中杉金桥生物技术有限公司;HPV16型引物由上海生工生物技术有限公司合成。HPV16引物序列:上游为5'-TCAAAAGCCACTGTGTCCTG-3'，下游为 5'-CGTGTTCTTGATGATCTGCA-3'，长度为 120 bp。

1.2 相关指标测定

1.2.1 HDAC1、P21waf表达 采用免疫组化 SP法，按试剂盒说明书操作，DAB光镜下控制染色，苏木素复染，盐酸酒精分化，干燥中性树胶封片。以PBS代替一抗为阴性对照。HDAC1阳性为宫颈异常鳞状上皮细胞核和少量细胞质出现棕黄色颗粒，P21waf阳性为细胞核出现棕黄色颗粒。光镜下每张切片随机观察5个有代表性的视野，计数阳性细胞并观察染色强度，根据阳性细胞百分率及染色强度计分。阳性细胞＜5%为0分，5%～25%为1分，26%～49%为2分，≥50%为3分。无着色为0分，弱着色为1分，中等着色为2分，强染色为3分。两项评分相加为0～1分判为阴性(-)，2分为弱阳性(+)，3～4分为中度阳性(++)，5～6分为强阳性(+++)，阳性细胞数 ＜5%的无论染色强度均判为(-)。

1.2.2 HPV16 DNA检测 采用常规方法提取组织切片中的 HPV DNA，取 25 μL 2 × PCR Master，1 μL DNA模板，上下游引物各1 μL及22 μL去离子水放入PCR反应管中，通过变性、退火、延伸、循环进行PCR扩增，扩增后PCR产物行琼脂糖凝胶电泳，染色。取5 μL PCR扩增产物，于2%琼脂糖凝胶中电泳，与DNA标准相对分子质量(600 bp)进行对照，120 bp处出现条带者为HPV16 DNA阳性。统计阳性率。

1.3 统计学方法 采用SPSS16.0软件，行计数资料的χ2检验和等级资料的秩和检验。相关性用Spearman等级相关分析。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HPV16 DNA阳性率 宫颈炎组、CINⅠ组、CINⅡ组、CINⅢ组、宫颈癌组HPV16 DNA阳性率分别为10%(2/20)、36.4%(8/22)、50.0%(12/24)、66.7%(16/24)、75.0%(15/20)，CINⅠ组、CINⅡ组、CINⅢ组、宫颈癌组阳性率均高于宫颈炎组(P均＜0.05)，CINⅢ组、宫颈癌组阳性率均高于CINⅠ组(P 均 ＜0.05)。

2.2 HDAC1、P21waf表达 宫颈炎组、CINⅠ组、CINⅡ组、CINⅢ组和宫颈癌组HDAC1表达逐渐增强，表达强度与病理级别呈正相关(r=0.529，P＜0.01)。宫颈炎组、CINⅠ组、CINⅡ组、CINⅢ组及宫颈癌组P21waf表达逐渐降低，表达强度与病理级别呈负相关(r=-0.385，P ＜0.01)。见表1。

2.3 HPV16感染与HDAC1、P21waf的关系 各组HDAC1表达与HPV16感染均呈正相关(r=0.510，P ＜0.05)，P21waf表达与 HPV16 感染呈负相关(r=-0.468，P ＜0.05)。见表2。

表1 各组 HDAC1、P21waf表达

2.4 HDAC1与 P21waf的关系 各组 HDAC1的表达强度与 P21waf呈负相关(r=-0.349，P ＜0.05)。见表3。

表2 HPV16感染与HDAC1、P21waf的关系(例)

表3 HDAC1与P21waf表达的关系(例)

3 讨论

我国是宫颈癌的高发区，并且有年轻化趋势［2］。研究表明HPV16、18与宫颈癌及癌前病变关系密切，在世界范围内，50%以上的宫颈癌与HPV16感染有关［3］。HPV慢性持续感染后，其E6、E7癌基因整合入宿主细胞基因组中，产生的E6、E7癌蛋白可引起遗传基因改变，如癌基因激活、抑癌基因失活和表观遗传学组蛋白修饰改变(如组蛋白去乙酰化等)，导致肿瘤的发生。本研究发现，HPV16在宫颈炎组、CINⅠ组、CINⅡ组、CINⅢ组和宫颈癌组中的感染率分别为10%、36.4%、50%、66.7%、75%，提示随着宫颈病变的加重，HPV16的感染率逐渐增加，与黄顺玲等［4］的研究结果一致。

HDAC1能够移去组蛋白Lys残基上的乙酰基，恢复组蛋白的正电性，增加组蛋白与DNA之间的吸引力，使启动子不容易接近DNA上的转录调控元件，从而抑制DNA转录。HDAC1除了移去组蛋白的乙酰基外，还可移去非组蛋白上的乙酰基，从而使部分非组蛋白失去其原有的肿瘤抑制功能，例如移去P53蛋白、Rb蛋白、P21蛋白等的乙酰基可导致其功能丧失，引起细胞周期调控紊乱，致使肿瘤发生、进展。目前研究显示，HDAC1在肿瘤细胞中高表达可明显增加肿瘤细胞的增殖能力，并且可以使肿瘤细胞的侵袭和移行能力明显增强［5］。本研究发现，宫颈炎组、CINⅠ组、CINⅡ组、CINⅢ组和宫颈癌组HDAC1的表达强度逐渐增强，且HDAC1蛋白表达强度与病变级别呈正相关，提示HDAC1与宫颈癌的发生、发展密切相关，可能作为宫颈癌演进过程中的分子标记物［6］。

HDAC和SP1竞争与P21基因启动子的结合，能够导致P21waf蛋白转录抑制，从而引起肿瘤的发生和进展，其抑制剂可以抑制HDAC和SP1竞争与P21基因启动子的结合，促进P21waf蛋白转录，抑制肿瘤的发生。目前已有研究证明，HDAC抑制剂在结肠癌、胃癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌中可能通过调节P21waf蛋白的转录和表达，抑制肿瘤的发生和发展。王慧等［7］将HDAC抑制剂SAHA作用于体外培养的宫颈癌细胞株Siha，发现SAHA在体外能有效抑制Siha生长，且对正常细胞无明显影响，其抗肿瘤机制之一可能是通过上调P21waf蛋白表达水平和引起G0/G1期细胞周期阻滞实现的。研究发现P21waf在宫颈病变中扮演的是肿瘤抑制基因的角色，且P21waf在宫颈癌中的失活是通过HPV16感染后癌基因E7发挥作用的［8］。本研究发现，在宫颈炎组、CINⅠ组、CINⅡ组、CINⅢ组及宫颈癌组，P21waf阳性表达率逐渐减低，表达强度与病变级别呈负相关，结合HDAC1与不同病变宫颈组织的病理级别呈正相关，说明在宫颈病变中HDAC1的高表达可能抑制P21waf蛋白的表达，促进宫颈癌的发生和进展。

综上所述，HPV16持续感染后，引起HDAC1高表达和P21waf的低表达，说明HPV16感染有可能是通过提高HDAC1水平、抑制P21waf的表达，导致宫颈癌的发生发展。三者联合检查能提高宫颈癌筛查的阳性率。

［1］唐俭，唐孝亮，李秀荣.586例健康妇女HPV16、18型感染情况分析［J］.检验医学与临床，2009，6(18):248.

［2］杨小风，王雅莉，刘惠娜，等.两种宫颈锥切术治疗子宫颈上皮内瘤变效果观察［J］.中国综合临床，2010，26(10):1093.

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［4］黄顺玲，王晓春，陈卫群.宫颈组织临床样本HPV16-E6的阳性率检测［J］.中国现代医学杂志，2006，16(24):3720-3722.

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［6］Huang BH，Laban M，Leung CH，et al.Inhibition of histone deacetylase 2 increases apoptosis and p21Cip1/WAF1 expression，independent of histone deacetylase 1［J］.Cell Death Differ，2005，12(4):395-404.

［7］王慧，徐赛.组蛋白去乙酰化酶抑制剂联合顺铂宫颈癌细胞化疗增敏作用的研究［J］.现代妇产科进展，2011，20(2):105-109.

［8］Shin MK，Balsitis S，Brake T，et al.Human papillomavirus E7 oncoprotein overrides the tumor suppressor activity of p21Cip1 in cervical carcinogenesis［J］.Cancer Res，2009，15，69(14):5656-5663.