苦参碱对慢性萎缩性胃炎模型大鼠胃黏膜的保护作用

董 燕，李银霞，严 祥

(1连云港市第二人民医院，江苏连云港222000;2兰州大学第一医院)

苦参碱是从苦豆子中提取的一种生物碱，可用于抗病毒、某些癌症、炎症、杀虫、抗纤维化和心脏疾病。研究表明，苦参碱具有免疫调节功能，能够降低IL-4［1］、转化生长因子-β1(TGF-β1)［2］、增殖细胞核抗原(PCNA)［3］、B 细胞白血病/淋巴瘤-2(Bcl-2)［4］的表达，抑制巨噬细胞和淋巴细胞活性。研究显示，在慢性萎缩性胃炎(CAG)患者胃组织中，PCNA［5］、Bcl-2蛋白［6］和 TGF-β1表达增高。2007 ～2009 年，我们从分子表达和病理变化的角度探讨了苦参碱对CAG模型大鼠胃黏膜的保护作用，旨在为临床治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1．1 材料 清洁级Wistar大鼠53只，体质量(144±3)g，购自兰州军区兰州总医院。主要试剂:IL-4、INF-γ、PCNA、Bcl-2、TGF-β1ELISA 试剂盒 (美国ADL公司);乙醇(天津市百世化工有限公司);水杨酸钠(天津化学试剂一厂);N-甲基-N-硝基-亚硝基胍［MNNG，梯希爱(上海)化成工业发展有限公司］;氨水(白银良友化学试剂有限公司);叶酸(天津飞鹰制药有限公司)，用蒸馏水稀释至40 mg/kg;苦参碱(兰州大学第一医院药剂科，纯度98%)，用蒸馏水稀释至180 mg/kg。

1．2方法

1．2．1 模型制作与给药 53只大鼠适应性喂养1周后随机分为模型组19只、叶酸组12只、苦参碱组11只、正常组12只。正常组自由饮食，同时以模型组等量自来水灌胃。CAG模型制作方法:大鼠第2周第1、2天给予20 mmoL/L去氧胆酸钠自由饮用，饱食，从第3天开始饱食1 d禁食1 d，禁食当天下午以40%乙醇与2%水杨酸钠交替灌胃2．5 mL/d。第3周开始饱食2 d禁食1 d，禁食当天下午以40%乙醇与2%水杨酸钠交替灌胃，2．5 mL/d，共3周，此为造成胃黏膜的浅表性炎症以刺激胃黏膜修复。第6周开始每周三、周日禁食，禁食当天下午以40%乙醇与2%水杨酸钠交替灌胃，2．5 mL/d，其余时间饱食，同时将100μg/mL MNNG装在涂漆瓶中自由饮用至16周末。第17周每天给予0．1%的氨水自由饮用，每周以60%乙醇与2%水杨酸钠交替灌胃2次/周，直到24周造模结束。因受实验条件的限制大鼠未分笼饲养，造模期间因相互攻击死亡19只，其中模型组11只、正常组2只、苦参碱组3只、叶酸组3只。所有死亡大鼠分别在胃窦与胃体交界处和病变明显处各取一小块长方形组织做病理切片观察，其中模型组6只有肠上皮化和萎缩，表明造模成功。第25周开始给药，叶酸组给予叶酸40 mg/(kg·d)灌胃，苦参碱组给予苦参碱180 mg/(kg·d)灌胃，正常组和模型组给予等量自来水灌胃，1次/d，共45 d。治疗期间模型组、叶酸组、正常组各死亡1只，苦参碱组死亡3只。

1．2．2 标本采集方法 实验结束后所有大鼠禁食24 h，称体质量，戊巴比妥钠麻醉取胃，沿胃大弯切开，用生理盐水冲洗，分别在胃窦和病变明显处取3 mm×10 mm的长方形组织，一部分用10%甲醛固定，石蜡包埋，用于病理检查;另一部分－80℃冷冻，用于蛋白含量检测。

1．2．3 病理评分方法 取胃组织石蜡标本，梯度乙醇脱水，0．4μm连续垂直切片3张，显微镜下观察。评分标准:①炎性细胞:无炎性细胞计0分，有中性粒细胞计1分，有淋巴细胞计2分，有单核细胞计3分，嗜酸性粒细胞计4分。②炎症程度:无炎症计0分，在胃黏膜表层或底部有少量散在的炎细胞计1分，在胃黏膜各部分均有较多的炎细胞计2分，炎细胞遍布黏膜全层或形成淋巴小结或成堆聚集计3分。③胃黏膜糜烂:无糜烂计0分，被覆上皮细胞浅表损害计1分，胃小凹以上损害计2分，黏膜小凹以下损害计3分。④非典型增生:无增生计0分，累及胃黏膜上皮层的下1/3计1分，累及胃黏膜上皮层的下2/3计2分，累及上皮层2/3以上但未达到全层计3分。⑤肠上皮化生:无计0分，有计1分。⑥核分裂:无计0分，有计1分。

1．2．4 蛋白含量检测 取胃组织冷冻标本，采用考马斯亮蓝法检测胃黏膜组织中 INF-γ、IL-4、TGF-β1、Bcl-2、PCNA蛋白含量，具体操作方法按ELISA试剂盒说明书进行。计算公式:蛋白含量(mg·prot/mL)=(测定管OD值－空白管OD值)/［(标准管OD值－空白管OD值)×蛋白标准浓度］。

1．2．5 统计学方法 采用SPSS10．0统计软件，体质量和生化指标检测结果以¯x±s表示，病理指标采用平均次表示。所有资料都属于非正态分布，病理指标采用多组有序变量资料的秩和检验进行分析，各组蛋白表达先采用多组连续变量资料的秩和检验进行分析，有意义的再进行两组连续变量资料的秩和检验进行两两比较，并采用Spearman等级相关分析对模型组各指标进行相关性分析。P≤0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 各组病理学检查结果比较 肉眼观察到各组胃黏膜均有充血，偶有少量点状出血，组间比较无明显差异。显微镜下可见正常组胃黏膜上皮完整，上皮细胞排列整齐，无脱落或缺损，固有膜腺体形状规则，受浸润的细胞主要为嗜酸性粒细胞。模型组胃黏膜不完整，可见不同程度的变性或坏死的脱落细胞，胃组织受浸润的炎细胞有淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和少量单核细胞，其中以淋巴细胞为主，胃黏膜腺体也有不同程度的减少和肠上皮化生。苦参碱组胃黏膜受浸润的炎细胞主要为嗜酸性粒细胞，且受浸润的炎细胞数量显著低于模型组和叶酸组。各组病理检测评分结果见表1，光镜下大鼠胃黏膜切片见图1。

表1 各组病理检测评分结果比较(分)

图1 HE染色光镜下各组胃黏膜切片

2．2 各组胃黏膜 IL-4、PCNA、Bcl-2、INF-γ、TGF-β1蛋白水平比较 见表2。与正常组比较，模型组胃黏膜 PCNA、Bcl-2、INF-γ、TGF-β1蛋白含量增加(P均＜0．05);与模型组比较，苦参碱组胃黏膜PCNA、Bcl-2、INF-γ、TGF-β1蛋白含量显著减少(P 均 ＜0．05)。

表 2 各组胃黏膜 PCNA、Bcl-2、INF-γ、IL-4、TGF-β1表达水平比较(mg·prot/mL ±s)

表 2 各组胃黏膜 PCNA、Bcl-2、INF-γ、IL-4、TGF-β1表达水平比较(mg·prot/mL ±s)

注:与模型组比较，#P ＜0．05

组别 n PCNA Bcl-2 INF-γ IL-4 TGF-β1模型组 8 153．1 ±38．7 124．9 ±20．8 28．0 ±5．6 160．7 ±59．4 229．0 ±79．5叶酸组 9 54．1 ±21．1#66．0 ±15．9#17．2 ±3．5#128．4 ±40．0 134．6 ±44．0#苦参碱 8 54．4 ±14．5#81．3 ±21．9#15．6 ±6．0#130．0 ±29．6 132．3 ±48．3#正常组 8 39．8 ± 8．0#71．4 ±13．9#17．1 ±4．3#119．2 ±41．2 113．6 ±68．9#

3 讨论

CAG是最常见的癌症相关性死亡的原因之一［7］。CAG的发生与Hp感染、自身免疫机制和遗传因素、十二指肠反流、胃黏膜损伤因子(如乙醇、高盐、长期服用非甾体类抗炎药物)等有关。由于长期慢性炎症，导致腺体破坏而减少，黏膜变薄，在内窥镜下表现为胃黏膜血管显露。通常胃黏膜萎缩伴随胃纤维组织、淋巴滤泡和黏膜肌层的化生和增生，因此有时胃黏膜呈现粗糙和颗粒状的外观。CAG与胃癌尤其是肠型胃癌［8］呈显著正相关。本研究模拟人的发病因素，采用综合造模法成功复制了CAG、肠上皮化生的动物模型。结果显示，经苦参碱治疗后，各组体质量及胃黏膜充血无统计学差异，这可能与疾病早期及大鼠自身胃黏膜存在较强的修复能力有关;但苦参碱可以减轻或控制大鼠胃黏膜炎症、萎缩和非典型增生的程度，尤其在控制炎症方面强于叶酸;另外，苦参碱组PCNA、Bcl-2、INF-γ、TGF-β1蛋白表达水平显著低于模型组。

Bcl-2作为一种凋亡抑制基因，其过度表达可抑制细胞程序性死亡，在65%伴有肠上皮化生的萎缩性胃炎和81%不典型增生上皮中可见到Bcl-2蛋白表达。PCNA又称为周期蛋白，是DNA多聚酶δ的一种辅助因子。静止细胞含量很少，G1晚期开始增多，S期达到高峰，G2期、M期含量较低，是评价细胞增殖状态的重要指标。研究显示，胃黏膜发生肠化生前，细胞凋亡指数和增殖指数均呈递增趋势，细胞凋亡与细胞增殖呈正相关，凋亡与增殖比接近1，但到肠化生、不典型增生、胃癌时期，细胞凋亡指数逐渐降低，而细胞增殖仍呈递增趋势，细胞凋亡与细胞增殖呈负相关，凋亡与增殖比小于1。由浅表性胃炎向 CAG、肠化生、非典型增生、胃癌演变过程中，Bcl-2和PCNA蛋白表达阳性率逐渐增加。TGF-β1在增殖活跃的细胞中和纤维增生组织中表达较高。TGF-β1蛋白的表达随非化生性萎缩性胃炎萎缩程度的增加而呈上升趋势，提示TGF-β1可能在非化生性萎缩性胃炎的发展过程中起重要作用。

本研究显示，模型组 PCNA、Bcl-2、TGF-β1、INF-γ蛋白表达水平显著高于正常组，与以往文献［9］报道相符。其机制可能为:CAG发生时，机体反射性引起细胞增殖相关分子的表达，而凋亡基因也处于活跃状态，故基因调节极不稳定，易导致CAG向非典型增生和胃癌进展。本研究证实，模型组非典型增生的程度明显高于正常组，经苦参碱治疗后PCNA、Bcl-2、TGF-β1、INF-γ 蛋白的表达和非典型增生的程度明显下降。推测苦参碱可能通过降低PCNA、Bcl-2、TGF-β1的表达控制 CAG 引起的反射性细胞增殖程度，从而防止基因调节失控致其向胃癌进展。另外，CAG多伴有纤维组织增生变化，而TGF-β1是调节纤维增生的重要因子，苦参碱可能具有降低该因子的表达而减轻这种病理变化的作用。INF-γ是介导慢性炎症细胞免疫最主要的因子，而IL-4是介导慢性炎症体液免疫最主要的因子。理论上，CAG是以淋巴细胞浸润为主，本研究也证实了模型组胃黏膜受浸润的炎性细胞主要为淋巴细胞，其次有少量中性粒细胞，并且模型组INF-γ的表达显著高于正常组，而IL-4的表达却无明显统计学差异，经苦参碱治疗后INF-γ水平下降，淋巴细胞和中性粒细胞浸润程度也显著低于模型组和叶酸组。说明苦参碱可能通过降低INF-γ表达来控制胃黏膜炎症反应程度。此外，病理检查发现，胃黏膜嗜酸性粒细胞较多，但正常组胃黏膜也有大量嗜酸性粒细胞，这可能是大鼠与人CAG病理变化不一致的地方。实验过程中发现，苦参碱组嗜睡，精神状态明显不如其他组，且胃黏膜充血糜烂程度高于其他组，这可能与苦参碱具有中枢抑制作用和胃黏膜刺激性有关。

综上所述，苦参碱可通过降低 PCNA、Bcl-2、INF-γ、TGF-β1的表达缓解胃黏膜炎性细胞浸润的程度，从而阻止CAG向胃癌进展。苦参碱在CAG炎症控制和防止其向胃癌进展方面疗效较好，但其不良反应、用药剂量及疗程仍有待进一步深入研究。

［1］Zhang R，Jing T．An approach to the mechanism of matrine and albendazole against Echinococcus multilocularis infection in mice［J］．Zhongguo Ji Sheng Chong Xue Yu Ji Sheng Chong Bing Za Zhi，2006，24(5):366-369．

［2］凌伟，谢敏，石俊青．苦参碱对肺成纤维细胞TGF-β1信号转导途径的干预作用［J］．四川大学学报，2009，40(6):994-999．

［3］Liu T，Song Y，Chen H，et al．Matrine inhibits proliferation and induces apoptosis of pancreatic cancer cells in vitro and in vivo［J］．Biol Pharm Bull，2010，33(10):1740-1745．

［4］ Liang CZ，Zhang JK，Shi Z，et al．Matrine induces caspase-dependent apoptosis in human osteosarcoma cells in vitro and in vivo through the upregulation of Bax and Fas/FasL and downregulation of Bcl-2［J］．Cancer Chemother Pharmacol，2012，69(2):317-331．

［5］Sun LH，Li Q，Wang SQ．Relationship of TCM syndrome type of gastric mucosal epithelial growth factor，vascular endothelial growth factor and proliferative cell nuclear antigen in patients with chronic atrophic gastritis［J］．Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi，2008，28(3):225-228．

［6］Wang LJ，Chen SJ，Chen Z，et al．Morphological and pathologic changes of experimental chronic atrophic gastritis(CAG)and the regulating mechanism of protein expression in rats［J］．J Zhejiang Univ Sci B，2006，7(8):634-640．

［7］Yang L．Incidence and mortality of gastric cancer in China［J］．World J Gastroenterol，2006，12(1):17-20．

［8］王吉耀．萎缩［M］//刘文忠．内科学(上册)．2版．北京:人民卫生出版社，2010:430．

［9］徐珊，王常松，周嘉鹤，等．慢性萎缩性胃炎不同中医证型模型大鼠胃黏膜细胞增殖基因表达［J］．中国中西医结合杂志，2007，27(11):1004-1006．