青藤碱对佐剂性关节炎大鼠行为学特征和滑膜中TNF-α的影响

牟 慧，蔡 辉，姚茹冰，赵智明

(第二军医大学临床学院、南京军区南京总医院，南京210002)

中药青风藤具有祛风湿、通经络、镇痛的功效，用于治疗风湿痹痛、关节肿痛等已有两千多年的历史，目前广泛用于治疗类风湿关节炎(RA)和神经痛等疾病［1］。2012年4～7月，我们观察了青藤碱对佐剂性关节炎大鼠行为学特征及滑膜中炎性因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)表达的影响，以探讨其改善RA症状的机制。

1 材料与方法

1．1 材料 清洁级健康雄性SD大鼠40只，体质量(90±20)g，由南京军区南京总医院实验动物中心提供。甲氨蝶呤(江苏恒瑞医药有限公司)，青藤碱(湖南正清制药集团股份有限公司)，弗氏完全佐剂(CFA，Sigma公司)，TNF-α 检测试剂盒(ELISA，Keygen公司);光学显微镜(OLUMPUS)，390型足底辐射热痛觉测试仪和2390-5型触痛觉测试仪(IITC Life Science，Inc)。

1．2 方法

1．2．1 佐剂性关节炎模型的复制及分组干预 选用40只SD大鼠，适应性喂养1周，随机分为正常组10只和CFA造模组30只。造模组向大鼠右侧后肢足垫皮下注射0．1 mL CFA［2］，以注射后 3 ～4 h 大鼠右侧后足出现红、肿、热等急性炎症表现，2～3 d其他肢体亦渐出现继发性关节肿胀为造模成功。将造模成功大鼠随机分为模型组、青藤碱组和甲氨蝶呤组各10只，分别给予生理盐水0．5 mg/(kg·d)、青藤碱 100 mg(kg·d)、甲氨蝶呤 0．5 mg(kg·周)，共4周，于实验第30天处死全部大鼠。

1．2．2 行为学检测 ①热痛阈值(PWL):大鼠造模后第8、16、24、30天用足底辐射热痛觉测试仪测定PWL。将大鼠放在玻璃板上，用有机玻璃观察框罩住，适应20 min后，应用390型足底辐射热痛觉测试仪检测热痛阈。光强度刺激设定为40%，聚光光源从下方直接照射左侧后爪足底，记录由照射到大鼠左后肢缩脚的时间，即PWL。每天测量5次，每次测试间隔10 min，单次光照射时间不超过20 s，以免造成热辐射损伤。去掉最大及最小值后，取3次的平均值作为后肢PWL。②回缩压力阈值(PWPT):大鼠造模后第8、16、24、30天采用触痛觉测试仪测定PWPT。将大鼠放在金属网上，用有机玻璃观察框罩住，适应20 min后，用尼龙丝从金属网下方持续加压，刺激大鼠左侧足底，直至引起大鼠缩爪或甩足，读取触觉测试仪上的压力值，即PWPT。每天测量5次，每次测试间隔10 min，去掉最大及最小值后，取3次的平均值作为PWPT。

1．2．3 滑膜组织学及行为学观察 腹腔注射氯胺酮麻醉大鼠，沿左侧后腿膝关节正中纵行切开皮肤，暴露以膝关节为中心约3 cm×3 cm的区域，沿髌骨上缘0．3～0．4 cm处向下切割直至髌骨，再沿髌骨两侧向下分离至胫骨，可见由髌骨下端向下延续有一层平滑光亮呈浅淡黄色的滑膜组织。用眼科镊钝性分离关节囊的滑膜层和纤维层，完整剥离滑膜组织，眼科镊夹住中央，最后用眼科剪完整剪下，10%中性甲醛固定，石蜡包埋，切片，HE染色，光镜下观察。取大鼠滑膜，用RIPA裂解缓冲液提取滑膜总蛋白后变性-80℃保存。按照ELISA试剂盒说明书检测滑膜组织中TNF-α的表达。

1．2．4 统计学方法 采用SPSS16．0统计软件，计量资料以¯x±s表示，多组均数比较采用单因素方差分析，两两比较用LSD法。P≤0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 各组PWL、PWPT比较 造模第8、16天，正常组PWL与其他各组比较P均＜0．01，青藤碱组、甲氨蝶呤组与模型组比较P均＞0．05;第24天青藤碱组与模型组比较P＜0．05，甲氨蝶呤组与模型组比较P＜0．01;第30天青藤碱组与模型组比较P＜0．05，而甲氨蝶呤组与模型组比较 P＜0．01。见表1。造模后第8天正常组PWPT与其他各组相比P均＜0．01，其他各组间无差异;第16天正常组与其他各组比仍P＜0．01，甲氨蝶呤组与模型组比较P＜0．01。见表2。

2．2 各组滑膜组织学检查结果比较 与正常组细胞相比，模型组滑膜上皮细胞明显增生，滑膜中弥漫炎性细胞浸润及纤维细胞增生，并有生发中心形成;青藤碱组滑膜上皮细胞增生较模型组模型减少且仅散在炎性细胞浸润;甲氨蝶呤组滑膜上皮细胞增生较模型组明显减轻，仅有散在炎性细胞浸润及较少量纤维组织增生。见图1。

表1 各组 PWL比较(s±s)

表1 各组 PWL比较(s±s)

注:与正常组比较，*P ＜0．01;与模型组比较，#P ＜0．05，##P ＜0．01

组别 n PWL第8天 第16天 第24天 第30天正常组 10 55．63 ±5．79 53．99 ±10．35 54．62 ±9．51 58．23 ±4．69模型组 10 21．82 ±6．91* 24．28 ± 3．30* 26．75 ±5．45* 27．64 ±6．55*青藤碱组 10 22．33 ±4．55* 30．39 ± 4．97* 34．16 ±7．38*# 43．91 ±7．84*##甲氨蝶呤组 10 26．31 ±6．14* 33．52 ± 8．72*## 37．14 ±8．85## 44．29 ±9．26*##

表2 各组PWPT比较(g±s)

表2 各组PWPT比较(g±s)

注:与正常组比较，*P ＜0．05，＊＊P ＜0．01;与模型组相比，#P ＜0．05，##P ＜0．01

组别 n PWPT第8天 第16天 第24天 第30天正常组 10 10．57 ±2．05 10．93 ±1．61 10．78 ±2．34 11．62 ±2．03模型组 10 4．63±1．62＊＊ 5．08 ±1．99＊＊ 5．68 ±2．42＊＊ 5．76 ±2．02＊＊青藤碱组 10 4．82±1．94＊＊ 6．49 ±1．64＊＊ 8．17 ±1．44*# 8．69 ±2．36＊＊#甲氨蝶呤组 10 5．41±1．49＊＊ 5．61±1．59＊＊ 8．59±2．52*## 9．12±2．09*##

图1 各组大鼠滑膜病理形态(200倍光镜)

2．3 各组滑膜中TNF-α含量比较 正常组、模型组、青藤碱组、甲氨蝶呤组滑膜中TNF-α含量分别为(17．28 ± 4．97)、(71．71 ± 14．63)、(33．63 ±11．48)、(17．28 ±4．97)pg/mL，与正常组比较，模型组滑膜中TNF-α含量显著升高(P＜0．01)。药物干预后，甲氨蝶呤组TNF-α较模型组显著降低(P＜0．01)，而与正常组比较无统计学差异(P＞0．05)。

3 讨论

RA是一种累及周围关节为主的系统性炎症性自身免疫性疾病，主要表现为慢性、对称性、进行性、侵袭性的多关节炎，滑膜的慢性炎症、增生逐渐形成血管翳，侵犯关节软骨、骨和肌腱等，最终导致关节疼痛、软骨及骨破坏，形成关节畸形和功能丧失［3］。RA多见于中年女性，其具体发病机制尚不完全清楚，当前的研究主要围绕感染因子展开。RA的主要病理改变是滑膜炎，炎性细胞渗出和浸润以及滑膜细胞增生导致慢性炎症性关节疼痛和压痛是RA最早的临床表现，抑制滑膜炎症进展、减轻关节疼痛对提高RA患者的生活质量有重要意义。TNF-α主要由单核—巨噬细胞分泌，是一种促炎性细胞因子，能够对炎症、感染和其他应激产生影响，引起广谱的生物效应，在免疫反应和炎症中起重要作用。目前认为，TNF-α可通过3条信号通路来实现其生物功能，即细胞凋亡信号通路、核转录因子NF-κB信号通路、促分裂原活化蛋白激酶信号通路，而TNF-α刺激NF-κB信号传导和JNK信号传导在RA的发病机制中起关键作用［4，5］。

中药青风藤为防己科植物青藤和毛青藤的干燥藤茎，味苦，性平，归肝脾经，具有祛风湿、镇痛之功效，用于治疗风湿痹痛和关节肿痛。明代李时珍的《本草纲目》中有“青风藤治风湿流注，历节鹤膝，麻痹瘙痒，损伤疮肿”的记载。盐酸青藤碱是从中药青风藤中提取的生物碱单体，具有镇痛抗炎、镇静、免疫抑制、抑制软骨破坏等作用，广泛用于治疗RA和神经痛等。药理研究显示，青藤碱是很强的组织胺释放剂，具有镇咳麻醉、降血压、免疫抑制等作用［1］。Zhou 等［6］发现，SIN 抑制胶原诱导的关节炎大鼠血清中TNF-α表达升高。Pang等［7］发现，青藤碱可抑制佐剂性关节炎大鼠巨噬细胞和滑膜细胞NF-κB活性，从而降低TNF-α表达。青藤碱在 RA治疗中发挥的抗炎镇痛作用主要与其抑制炎性细胞因子的表达有关。研究表明，各种细胞因子参与了RA的发病和演变，TNF-α、IL-1等炎性因子不但参与初始免疫应答，更通过抗原提呈细胞的作用参与免疫细胞活化，诱导金属蛋白酶产生，促进关节破坏，从而导致RA的慢性进展。张莹等［8］在体外实验中观察不同剂量青藤碱对TNF-α、IL-1表达的影响及对NF-κB转录活性的影响，证实青藤碱可抑制RA大鼠中 NF-κB的转录活性及减少 TNF-α、IL-1的mRNA表达。Wang等［9］通过实验观察到，青藤碱可以显著改善大鼠关节肿胀度，降低大鼠关节炎指数，减少血清中IL-1β及IL-6表达，进而抑制基质金属蛋白酶(MMP)-2和MMP-9的表达，证实了青藤碱对佐剂性关节炎的治疗作用。Chen等［10］观察了青藤碱对RA患者滑膜成纤维细胞中TNF-α通路介导的血管黏附分子及趋化因子的表达，为青藤碱治疗RA提供了体外实验依据。本研究结果显示，青藤碱可缓解大鼠关节疼痛，与文献［11］报道一致。考虑其机制与青藤碱抑制 TNF-α的表达相关。TNF-α通过与特异性受体结合激活胶质细胞和神经元，诱发疼痛产生［12］，因此减少TNF-α表达可缓解关节炎的关节疼痛。

总之，青藤碱在减轻关节炎症状及疼痛中的作用确切，是临床上治疗RA的有效药物之一，但其具体的作用机制仍值得进一步研究。

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