HPLC测定不同生长期和采收期太空莲叶中荷叶碱的含量

唐伯辰，梁华正，刘成佐，江旦林，2，廖晓峰

（1.东华理工大学化学生物与材料科学学院，江西 抚州344000；2.临川之信生物科技有限公司，江西 抚州344000）

荷叶为睡莲科植物莲的干燥叶，传统中医学认为荷叶有清暑化湿、升发清阳、凉血止血等功效。现代药理学研究表明，荷叶碱是荷叶的主要药效成分之一，荷叶碱具有刺激胰岛素分泌[1]、抗病毒[2]、降脂减肥[3]等作用，有关荷叶碱的分离提取及高效液相色谱分析方法的文献报道较多[4-8]。抚州市广昌县种植白莲有1 300多年的历史，享有“白莲之乡”的美誉，从1994年至今，广昌白莲先后两次进行太空育种，选育后的太空莲品种大大提高了莲子产量，但对于太空莲叶中荷叶碱含量的研究鲜见报道[9]。本文采用高效液相色谱法对不同生长期的太空莲叶中荷叶碱的含量进行了测定，为充分利用荷叶资源提供参考。

1 仪器与试剂

1.1 主要仪器

LC-20AT/SPD-10A高效液相色谱仪(日本岛津)；N2000色谱数据工作站(浙江大学智达信息工程有限公司)；电子天平（梅特勒托利多仪器有限公司）；酸度计（上海雷磁）；HH-4数显恒温水浴锅（国华电器有限公司）。

1.2 材料与试剂

荷叶（采自江西省抚州市广昌县）经东华理工大学生物系饶军教授鉴定为睡莲科植物莲Nelumbo nucifera Gaertn.的干燥叶；乙腈（色谱纯，西陇化工股份有限公司）；荷叶碱对照品（中国药品生物制品检定所）；水为二次蒸馏水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 对照品溶液的配制 取荷叶碱对照品适量，精密称定，置25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，分别配制成0.8 mg/mL的溶液备用。

2.1.2 供试品溶液的制备 将新鲜荷叶用水洗净，70℃烘干，粉碎，过40目筛，取约1.0 g，精密称定，置于圆底烧瓶中，每次加pH 2.0的90%甲醇溶液50 mL，回流提取2 h，提取两次，滤过于100 mL容量瓶中，用pH 2.0的90%甲醇溶液洗涤、稀释至刻度，摇匀，备用。再精密吸取25 mL，置50 mL容量瓶中，用pH 2.0的90%甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，备用。

2.2 色谱条件

色谱柱为Hypersil BDS C18柱 (4.6 mm×250 mm，5.0μm)；流动相为乙腈-水-三乙胺-乙酸（27∶70.6∶1.6∶0.78）；流速为1.0 mL/min；检测波长为270 nm；进样量为20μL；柱温为室温。HPLC图见图1。

图1 荷叶碱对照品(a)和供试品溶液(b)色谱图

2.3 线性关系考察

分别取0.2 mg/mL荷叶碱对照品溶液0.5、1、2、4、6、8、10 mL于10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，精密量取各溶液20μL注入色谱仪，记录荷叶碱峰面积，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，进行线性回归，得回归方程为：

结果表明荷叶碱对照品溶液在0.01～0.2 mg/mL浓度范围内线性关系良好。

2.4 精密度试验

精密吸取荷叶碱对照品溶液20μL，连续进样6次，荷叶碱峰面积的RSD为0.9%，表明精密度良好。

2.5 稳定性试验

精密吸取荷叶供试品溶液20μL，分别在0、2、4、6、8 h进样，测定荷叶碱的峰面积，结果RSD为1.2%，表明供试品溶液在8 h内较稳定。

2.6 重复性试验

取同一采集地点和时间太空莲叶样品5份，按“2.1.2”项方法分别制备供试品溶液，测定峰面积并计算含量为0.455%，RSD为1.4%。

2.7 回收率试验

取荷叶粉末1 g，精密称定，分高、中、低3个浓度，分别加入荷叶碱对照品溶液0.5、1、1.5 mL，按上述供试品溶液的制备方法及色谱条件进行测定，结果平均回收率为98.7%，RSD=1.5%。结果见表1。

表1 荷叶碱加样回收率测定结果表

2.8 不同采收期太空莲叶中荷叶碱含量

按药典要求，荷叶采收期一般为夏秋两季，因此选取6月至10月为样品采集期。由于采集期内的大部分时间段，荷塘中都有多种不同生长状态的荷叶，荷叶生长大致可分为5个阶段，初生嫩叶，生长期嫩叶，近成熟叶，成熟叶，衰老叶[10]。因此在每个时间点均采集5个不同生长期的荷叶样本，选取的采集时间点为6月5日、7月5日、8月5日、9月5日、10月5日，每次采集5组不同太空莲叶，分别为：初生期嫩叶，叶子刚由叶芽展开，叶片单薄，青绿色；生长期嫩叶，叶片舒展，黄绿色，质嫩；近成熟叶，叶子直径已近成熟，黄绿色；成熟叶，叶片宽大，绿色，叶片厚实；衰老叶，叶子边缘萎蔫，黄褐色[10]。依法分别测定5个采集期内5种不同生长状态的荷叶中荷叶碱的含量，结果见表2。

由表2可知，8月5日的初生嫩叶荷叶碱含量最高，但是由于初生嫩叶生物量太小，而成熟叶和近成熟叶生物量大，因此一般荷叶采集以成熟叶和近成熟叶为主。由表2可知，5组不同荷叶样品，荷叶碱含量有显著差异性，近成熟叶的荷叶碱含量普遍大于成熟叶，而8月至9月的近成熟叶荷叶碱含量相对其他时间段的近成熟叶荷叶碱含量要高，因此建议荷叶应该在8月至9月采集近成熟叶为主。

表2 不同采集期内不同生长状态的太空莲叶中荷叶碱的含量 （n=3，±s，%）

表2 不同采集期内不同生长状态的太空莲叶中荷叶碱的含量 （n=3，±s，%）

注：6月与7、8、9月嫩叶比较**P＜0.01。

各期叶片初生嫩叶生长嫩叶近成熟叶成熟叶衰老叶6月5日0.235±0.003 0.305±0.005 0.356±0.007 0.201±0.004 0.106±0.006 7月5日0.331±0.004 0.372±0.005 0.391±0.008 0.322±0.005 0.125±0.007荷叶碱含量（%）8月5日0.522±0.005**0.489±0.004**0.466±0.006 0.355±0.008 0.113±0.005 9月5日0.501±0.007**0.488±0.006**0.455±0.009 0.368±0.004 0.156±0.007 10月5日未采到未采到0.436±0.008 0.388±0.007 0.185±0.006

3 讨论

3.1 流动相的选择

采用了不同比例的甲醇-水、乙腈-水为流动相，荷叶碱峰分离度小且峰型拖尾严重，加入0.78%的冰乙酸和1.6%的三乙胺，峰型较好，分离效果较好，可满足对样品的检测要求。

3.2 样品荷叶碱提取方法的选择

实验中采用了多种有机溶剂进行提取试验，如甲醇、乙醇、四氢呋喃、二甲亚砜、氯仿等，相对而言甲醇提取效果较好，且毒性相对较小，因此选用甲醇作为提取溶剂。同时还考察不同酸度和固液比对提取效率的影响，结果为以甲醇为提取溶剂，固液比为1∶50，回流提取2 h，提取次数为2次，pH 2.0时，荷叶碱提取率最高。

3.3 关于荷叶药材的质量

按药典要求，荷叶采收期一般为夏秋两季，作为药材的干荷叶，其荷叶碱含量要求大于0.1%。由于受品种、气候、水质、土壤环境甚至炮制工艺等因素影响，荷叶质量参差不齐，有关研究表明，以荷叶中的荷叶碱为指标成分，采用高效液相色谱法进行含量测定，结果在随机抽取的24个样品中，仅2个样品合格，22个样品不合格，合格率为8.3%[11]。太空莲近成熟叶中荷叶碱含量达到0.45%以上，高于一般荷叶的荷叶碱含量[10-11]。目前在抚州市广昌县，太空莲种植集约化程度相对较高，具有较好的开展中药材GAP种植的条件，因此太空莲叶作为荷叶药材资源具有较好的前景。

荷叶在上世纪90年代就被列入“既是食品又是药品”的名单，我国具有丰富的荷叶资源，在“莲子之乡”的抚州市广昌县，莲农采摘莲子之后，荷叶都枯萎在荷塘里自然腐烂，浪费了资源。本文通过对太空莲叶中荷叶碱的研究，为荷叶资源的开发利用提供了参考依据。

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