绞股蓝对2型糖尿病大鼠肾脏组织中MMP-9与TIMP-1表达的影响※

郎志芳 刘兰涛 王洪伟 吴 琦

绞股蓝对2型糖尿病大鼠肾脏组织中MMP-9与TIMP-1表达的影响※

郎志芳 刘兰涛 王洪伟 吴 琦

目的观察绞股蓝对2型糖尿病大鼠肾脏的组织（TIMP-1）金属蛋白酶组织抑制物1、(MMP-9)基质金属蛋白酶表达的影响。方法建立2型糖尿病大鼠模型，分为糖尿病组，绞股蓝高、中、低剂量组。给药 6 周后，应用免疫组化方法检测各组大鼠肾脏的组织中TIMP-1、MMP-9的表达情况。结果糖尿病组TIMP-1明显增高、而 MMP-9的表达明显降低（P＜0.01）；绞股蓝治疗组随着剂量的增加TIMP-1逐渐降低、 MMP-9逐渐增高（P均＜0.01）。结论绞股蓝对2型糖尿病大鼠肾脏纤维化有保护作用，其机制可能是通过下调大鼠肾组织TIMP-1 和上调MMP-9的表达来实现的。

绞股蓝；2 型糖尿病；MMP-9；TIMP-1

糖尿病肾病（Diabetic Nephropathy, DN）是糖尿病最常见的并发症，也是导致肾功能衰竭的主要原因。糖尿病肾病的主要病理改变是细胞外基质（ECM）积聚和肾小球基底膜增厚。ECM积聚主要是由于ECM产生增多和降解障碍所致，而基质金属蛋白酶（MMPs）及其抑制剂金属蛋白酶组织抑制物（TIMPs）在ECM合成和降解的生理平衡中起重要作用。

绞股蓝（Gynostemma pentaphyllum(Thunb.) Makino）又名七叶胆公罗锅底，葫芦科多年生攀缘草质藤本植物，研究发现，绞股蓝具有抗肿瘤，调节机体免疫力，降低血脂，心血管保护等多种生物活性。绞股蓝多糖是其主要活性成分。本研究采用免疫组化方法观察绞股蓝对2型糖尿病大鼠肾脏组织TIMP-1和MMP-9表达情况的影响，旨在探讨绞股蓝对2型糖尿病大鼠的肾脏保护作用及其相关机制。

1 资料与方法

1.1 材料绞股蓝颗粒由牡丹江医学院红旗医院制剂室提供，兔抗大鼠MMP-9、TIMP-1一抗购于武汉博士德生物工程有限公司；STZ 购自Sigma公司，二抗和DAB试剂盒购自北京中山金桥有限公司；PAS染色试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司。

1.2 实验动物雄性 Wistar 大鼠，6～8周龄，体重180g左右，由牡丹江医学院实验动物中心提供。

1.3 实验方法

1.3.1 实验分组参照刘云[1]和Masiello P[2]方法，将50只Wistar大鼠随机分为5组，每组10只，正常对照组和绞股蓝高、中、低剂量治疗组和2型糖尿病模型组。除正常对照组给予普通饲料喂养外，其余各组给予高糖高脂饲料，并于第四周腹腔注射STZ（按40mg/kg），并继续给予高糖高脂饲料，制备2型糖尿病大鼠模型。72h后尾静脉采血测定空腹血糖（FBG），FBG≥16.65mmol/L者判为造模成功。糖尿病模型组继续给予高糖高脂饲料。绞股蓝干预低、中、高剂量组除给予高糖高脂饲料外，分别灌胃给予绞股蓝50mg/kg、100mg/kg、200mg/kg，正常组和模型组灌服生理盐水。

1.3.2 空腹血糖测定空腹血糖（FBG）的测定，应用三诺 SXT 1 活力型血糖测试仪，从尾尖采血测定。

1.3.3 取材及冰冻切片免疫组化绞股蓝治疗6周后，取大鼠肾脏，4%甲醛固定。冰冻包埋，切片，冷丙酮固定后，分别滴加兔抗大鼠TIMP-1和MMP-9一抗，4℃过夜，pbs清洗5分钟，滴加二抗，37℃温育60min，DAB显色，封片。测定每个高倍镜视野中阳性细胞光密度和面密度。

1.4 统计学处理数据表示用SPSS 13.0统计软件进行统计学分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

绞股蓝对糖尿病大鼠肾脏组织中MMP-9、TIMP-1表达情况的影响。

正常对照组大鼠肾脏组织中，MMP-9表达量高而TIMP-1表达较少，糖尿病模型组中TIMP-1则明显增强和MMP-9表达明显减少（P＜0.01），而绞股蓝治疗组的TIMP-1和MMP-9表达介于正常对照组和糖尿病模型组之间（P＜0.05，表1）。

表1 各组肾组织MMP-9、TIMP-1数密度值的比较[n,(±s)]

表1 各组肾组织MMP-9、TIMP-1数密度值的比较[n,(±s)]

注：各模型组相比较*P＜0.05，**P＜0.01

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3 讨论

糖尿病肾病的主要病理改变是肾小球ECM沉积，主要原因是 ECM的产生过多或降解障碍，引起肾小球结构破坏和肾小球硬化，ECG由层粘连蛋白、Ⅳ型胶原纤维、连接蛋白等组成。研究表明，糖尿病肾病的发病过程中，常常伴有细胞外基质的合成、降解异常，而 MMP-9及其 TIMP-1在细胞外基质代谢中起重要作用。 MMP-9是调节ECM组成的重要的一种酶。MMP-9经过催化剂催化变为有活性的MMP-9，MMP-9与系膜细胞、细胞外基质以及纤溶酶原积极结合释放出纤溶酶，调解ECG的降解。

TIMP-1是特异性内源性抑制因子，TIMP-1能够封闭 MMP-9的活性中心，使MMP-9失活，使ECM降解受抑制，有学者研究表明，MMP-9/ TIMP-1 表达失衡在糖尿病肾病中发挥了重要的作用。TASHIRO等研究证实，MMP-9 和Ⅳ型胶原均在糖尿病肾病中显著升高。QI W等[3]研究发现系膜细胞在高糖环境中培养使MMP-9 表达增加而TIMP-1 表达减少。

绞股蓝具有益气健脾、养心安神、滋阴益肾、消痰化瘀的作用。其化学成分主要为绞股蓝皂苷和绞股蓝多糖类等多种成分。张永等[4]研究发现，绞股蓝可通过多个环节干预糖尿病肾病发病。本课题组先期研究发现绞股蓝皂苷通过降血脂、抗氧化、抗动脉硬化等作用，对糖尿病肾病起到保护作用。本实验显示，糖尿病模型组大鼠肾脏组织中MMP-9的表达明显降低，而TIMP-1的表达明显升高，促使ECM在糖尿病大鼠肾小球内的积聚，导致肾小球病变，糖尿病肾病的发病。绞股蓝可以调节MMP-9/TIMP-1的病态平衡，上调MMP-9和下调TIMP-1的表达，促进ECM的降解，从而对糖尿病肾病起到保护作用。

[1] 刘云,陈隽.不同糖代谢异常大鼠动物模型的建立[J].中国现代医学杂志,2007,17(15)：1804-1807.

[2] Masiello P, Broca C, Gross R, et al. Experimental NIDDM：development of a new model in adult rats administered streptozotocin and nicotinamide[J]. Diabetes, 1998,47(2)：224-229.

[3] QI W, Poronnik P, Young B, et al. Human cortical fibroblast responses to high glucose and hypoxia[J]. Nephron Physiol, 2004, 96(4)：121-129.

[4] 张永,张建鄂,吴平勇,等.绞股蓝总甙与缬沙坦治疗早期糖尿病肾病的对比研究[J].郧阳医学院学报,2007,26(4)：199-200.

R963

A

1673-5846(2013)06-0201-02

黑龙江省牡丹江医学院，黑龙江牡丹江 157011

牡丹江医学院科研项目（编号B200805）

刘兰涛，邮箱：llt7076@163.com。