Caco－2细胞中8－羟基二氢小檗碱和小檗碱对多药耐药基因表达的研究

熊茂来向绍蓉.湖北民族学院医学院，湖北 恩施 445000；.湖北民族学院附属民大医院，湖北 恩施 445000

【摘 要】 目的：研究8－羟基二氢小檗碱和小檗碱与多药耐药基因之间的作用。方法：采用MTT比色法测定药物的细胞毒浓度，适时定量PCR测定不同多药耐药基因的表达。结果：在1～100μM浓度范围内，8－羟基二氢小檗碱和小檗碱对Caco－2细胞无毒性作用；8－羟基二氢小檗碱和小檗碱对mdr 1和m rp 1的表达作用一致，在25～100μM范围内，小檗碱能明显降低mrp 2的mRNA表达，而8－羟基二氢小檗碱对其无明显影响。结论：8－羟基二氢小檗碱与小檗碱对mrp 2的基因表达差异较大，其对MRP 2蛋白表达的作用以及与基因调控之间的作用关系还有待更进一步的研究。

【关键词】8－羟基二氢小檗碱；小檗碱；Caco－2细胞；多药耐药基因

【中图分类号】R965【文献标志码】A【文章编号】1007－8517（2013）23－0008－03

Caco－2细胞中8－羟基二氢小檗碱和小檗碱对多药耐药基因表达的研究

熊茂来1向绍蓉21.湖北民族学院医学院，湖北 恩施 445000；2.湖北民族学院附属民大医院，湖北 恩施 445000

【摘 要】 目的：研究8－羟基二氢小檗碱和小檗碱与多药耐药基因之间的作用。方法：采用MTT比色法测定药物的细胞毒浓度，适时定量PCR测定不同多药耐药基因的表达。结果：在1～100μM浓度范围内，8－羟基二氢小檗碱和小檗碱对Caco－2细胞无毒性作用；8－羟基二氢小檗碱和小檗碱对mdr 1和m rp 1的表达作用一致，在25～100μM范围内，小檗碱能明显降低mrp 2的mRNA表达，而8－羟基二氢小檗碱对其无明显影响。结论：8－羟基二氢小檗碱与小檗碱对mrp 2的基因表达差异较大，其对MRP 2蛋白表达的作用以及与基因调控之间的作用关系还有待更进一步的研究。

【关键词】8－羟基二氢小檗碱；小檗碱；Caco－2细胞；多药耐药基因

【中图分类号】R965【文献标志码】A【文章编号】1007－8517（2013）23－0008－03

小檗碱（Berberine）存在于许多植物如黄连等的根和根皮中，具有显著的抗菌活性。近年发现还有抗心律失常、降血脂等广泛的药理作用，尤其是其在糖尿病治疗中的应用有大量临床报道［1］。但小檗碱很难从消化道吸收，其吸收困难的原因为小檗碱是肠上皮细胞的P－糖蛋白作用底物。8－羟基二氢小檗碱是小檗碱的衍生物其中一种［2］，药理实验发现，8－羟基二氢小檗碱与小檗碱在药理效应同等的情况下，其应用浓度较低，因此推测8－羟基二氢小檗碱的吸收好于小檗碱。因此，本文旨在研究8－羟基二氢小檗碱和小檗碱在与多药耐药基因之间的作用，探讨两者之间差异的可能原因。

1 仪器与试药

1.1 仪器 超净工作台（北京昌平长城空气净化工程公司）；CO2细胞培养箱（Heraeus，德国）；DM IRM型倒置显微镜（Leica，德国）；荧光分析仪（Hitachi，日本）；5810R型高速冷冻离心机（Eppendorf，德国）；7300型适时定量PCR仪（AB Inc.，美国）；酶标仪（Bio－Rad，美国）。

1.2 试药 盐酸小檗碱（含量97.9%，中国药品生物制品检定所）；8－羟基二氢小檗碱（含量95.1%，华中科技大学同济医学院陆付耳教授赠与）；胎牛血清（Hyclone，美国）；DMEM高糖培养基（Gibco，美国）；二甲基噻唑二苯基四唑溴盐（MTT）；BCA蛋白分析试剂盒（Pierce，美国）；tRNA提取试剂（RNA STAT 60，TEL－TEST Inc.，美国）。

2 方法与结果

2.1 Caco－2细胞培养 Caco－2细胞培养基采用10g／L的DMEM高糖溶液，加入10%胎牛血清，添加青霉素（10万单位／L）、1%的非必需氨基酸和0.1 g／L的链霉素，培养条件为恒温37℃和5%CO2，消化液为0.25%胰蛋白酶－0.02%EDTA溶液。

调整Caco－2细胞密度为（1～2）×104个／ml，接种200L于96孔上，贴壁后，加入含药物的培养液，用于细胞毒性实验；调整Caco－2细胞密度为1×105个／m l，接种1m l于60mm培养皿上，置于培养箱中培养，每隔2天更换一次培养液，培养约7天形成单分子层膜后，用于RTPCR实验。

2.2 Caco－2细胞的毒性实验 采用MTT法检测小檗碱和8－羟基二氢小檗碱对Caco－2细胞的毒性作用。96孔板接种细胞后24h，加入含药物的培养液，再培养24h后，加入5mg／ml的MTT溶液20Ll，继续培养4 h，去上清液，再加入DMSO溶剂200μI，放置于水平振荡器上振荡约10min，置酶标仪中490nm处测定OD值。结果见图1。经双侧t检验和统计学方差分析表明，在1～100μM浓度范围内，小檗碱和8－羟基二氢小檗碱对Caco－2细胞无毒性作用；在150μM浓度和200μM浓度时，小檗碱和8－羟基二氢小檗碱对Caco－2细胞活力有显著毒性影响（P＜0.01）。

图1 不同浓度8－羟基二氢小檗碱和小檗碱溶液对Caco－2细胞的毒性影响（χ±s，n＝8）

2.3 适时定量PCR实验 60mm培养皿中接种Caco－2细胞后，培养5天至融合，加入8－羟基二氢小檗碱或小檗碱溶液（5～100μM）孵育24 h后，收集细胞，提取总RNA，并合成cDNA。设计的mdr 1，mrp 1和mrp 2引物见表1。36B4作为内参，每个反应体系总体系为14μL，包括2.33 pmol引物，4 ng cDNA，7μL SYBR Green PCR反应液。RT－PCR实验条件如下：50℃2min，95℃10 min，95℃15 s和60℃1min循环40次。计算方式如下［3］：mRNA量＝2（CT－CT36B4），CT表示仪器测定某种基因的扩增次数，CT36B4表示仪器测定内参36B4的扩增次数，以空白组数值为1。结果见图2。在实验浓度范围内，随着浓度升高，小檗碱和8－羟基二氢小檗碱对mdr 1的表达略有降低的趋势，但与空白组相比无明显差异；小檗碱和8－羟基二氢小檗碱对m rp 1的表达无明显影响；8－羟基二氢小檗碱对m rp 2的表达无明显影响，但在25～100μM范围内，小檗碱能明显降低mrp 2的mRNA表达。

表1 适时定量PCR的引物.

图2 8－羟基二氢小檗碱和小檗碱对mdr 1（A），mrp 1（B）和m rp 2（C）mRNA表达的影响（χ±s，n＝3）

3 讨论

采用Caco－2细胞进行药物吸收机制的研究，是一种很好的模拟肠管真实生存环境的体外方法，药物透过Caco－2细胞层的体外过程与药物口服在肠中的吸收有良好的相关性，在此基础上该模型还可用来研究载体如多药耐药蛋白与药物转运的关系，此方法便捷，重现性好，使我们在细胞水平上认识药物在肠中的吸收达到了一个新水平。

小檗碱作为一种天然植物生物碱成分，其理化性质、体内、外的吸收已有一些文献报道［4－6］。研究表明，小檗碱很难经消化道被人体吸收，仅有约5%的小檗碱从消化道吸收，而且吸收过程个体差异很大。此外，认为肠上皮细胞的P－糖蛋白参与小檗碱的向肠腔内外排，从而减少其吸收。8－羟基二氢小檗碱是根据小檗碱的前药原理合成的，在小檗碱的C8位加入羟基，使其C环发生一系列变化，季胺N变成叔胺N。该衍生物是一分子状态，易与细胞膜嵌合，从而较易通过细胞膜而被人体吸收，到达体液循环系统后在体内酶的作用下，转化成小檗碱，保留了其功能团部位，而发挥药理活性。

研究结果表明，在对多药耐药基因表达的影响方面，与小檗碱降低mrp 2表达相比，8－羟基二氢小檗碱对其表达无影响，而在对mdr 1和m rp 1的表达，两者作用趋势相同。据已有报道表明，小檗碱吸收少与P－糖蛋白介导的药物外排泵相关，加入P－糖蛋白抑制剂能增加小檗碱的肠道吸收，而本文实验结果为小檗碱不但没有增加反而有降低多药耐药相关蛋白MRP 2基因的表达，而且8－羟基二氢小檗碱与小檗碱对mrp 2的表达差异较大，因此其对MRP 2蛋白表达的作用以及与基因调控之间的作用关系还有待更进一步的研究。

［1］P.J.Gibbs，Seddon K.R..Berberine［J］.Alternative Medicine Review，2000，5（2）：175－177.

［2］徐丽君，陆付耳，魏世超，等.8－羟基二氢小檗碱与盐酸小檗碱治疗大鼠2型糖尿病的对比研究［J］.中西医结合研究，2009，1（4）：173－176.

［3］G.Liang，J.Yang，J.D.Horton，et al..Diminished hepatic response to fasting／refeeding and liver X receptor agonists in mice with selective deficiency of sterol regulatory element－binding protein－1c［J］.J.Biol.Chem.，2002，277（10）：9520－9528.

［4］Nobukazu Shitan，Miyako Tanaka，Koichiro Terai，et al.Human MDR1 and MRP1 recognize berberine as their transport substrate［J］.Biosci.Biotechnol.Biochem.，2007，71（1）：242－245.

［5］潘国宇，王广基，孙建国，等.小檗碱对葡萄糖吸收的抑制作用［J］.药学学报，2003，38（12）：911－914.

［6］Guoyu Pan，GuangjiWang，Xiaodong Liu，et al.The Involvement of PGlycoprotein in Berberine Absorption［J］.Pharmacol.Toxicol，2002，91（1）：193－197.

Study of 8－Hydroxydihydroberberine and Berberine on multidrug resistance gene in Caco－2 cellmodel

XIONGMao－lai1XIANG Shao－rong2
1.Themedical college of Hubei university for nationalities，Enshi445000，China；
2.Affiliated mingda hospital of Hubei University for nationalities，Enshi445000，China

Objective To investigate the effect of8－hydroxydihydroberberine and berberine onmultidrug resistance gene using Caco－2 cellmodel.M ethod The damage of8－hydroxydihydroberberine and berberine to Caco－2 cellwas evaluated by the MTTmethod.Expression ofmultidrug resistance gene includingmdr 1，mrp 1 and mrp 2 was determined by quantitative real time PCR.Result 8－hydroxydihydroberberine and berberine had no damage to the growth of the Caco－2 cells in the concentrations of1～100μM.8－Hydroxydihydroberberine and berberine had the same effects on the expression of mdr 1 and mrp 1 gene.Berberine significantly decreased the expression ofmrp 2 gene in the concentration of 25～100μM，but there was no effect in 8－hydroxydihydroberberinetreated groups.Conclusion The difference on the expression ofmrp 2 of 8－hydroxydihydroberberi－ne and berberinemay imply to further study the effects on the proteins and the relationship of them.

8－hydroxydihydroberberine；berberine；Caco－2 cell；multidrug resistance gene

2013.09.27）