柱前衍生高效液相色谱法测定太子参中精氨酸的含量

王欣美 王 柯 季 申

上海市食品药品检验所，上海 201203

柱前衍生高效液相色谱法测定太子参中精氨酸的含量

王欣美 王 柯 季 申

上海市食品药品检验所，上海 201203

目的：建立太子参药材中精氨酸的含量测定方法。方法：样品用0.1mol／L盐酸－乙醇（9：1）混合溶液提取，采用邻苯二甲醛（OPA）与一氯甲酸芴甲酯（FMOC）联用全自动柱前衍生化，Hypersil ODS柱，波长为338nm，检测太子参药材中精氨酸的含量。结果：精氨酸在0.2～4μg范围内呈良好的线性关系，平均回收率为101.2%。结论：本方法灵敏、准确，快速，具有良好的重复性和稳定性，可用于太子参中精氨酸的含量测定。不同产地来源、不同批次太子参中的精氨酸含量存在一定差异。

太子参；氨基酸；柱前衍生；HPLC

太子参为《中国药典》收载的常用补益中药，别名孩儿参、童参、四叶参、米参等，系石竹科植物孩儿参［Pseudostellaria heterophylla（Miq.）Pax］的干燥块根，具有益气健脾、生津润肺等功效。临床用于脾虚体倦、食欲不振、病后虚弱、气阴不足、自汗口渴、肺燥干咳等症状。研究表明，太子参中含有环肽、氨基酸、多糖等化学成分。其中，氨基酸是太子参滋补功能的重要药用成分，与太子参的补益功效有着非常密切的关系［1－4］。因此，太子参中氨基酸成分应作为质量标准控制的一个重要指标，但在中国药典尚未制定氨基酸含量测定的相关标准。

氨基酸分析常用的方法主要有衍生化离子交换色谱法和衍生化高效液相色谱法，前者需要使用氨基酸分析仪，后者使用一般分析实验室常规配备的高效液相色谱仪和C18色谱柱即可完成，且分析时间短，灵敏度高，已逐渐取代氨基酸分析仪在许多领域中的应用。常用的柱前衍生化HPLC测定氨基酸的方法有AQC（6－氨基喹啉－N－羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯）法、DNFB（2，4－二硝基氟苯）法、DABS（磺酰氯二甲胺偶氮苯）法、PITC（异硫氰酸苯酯）法和OPA－FMOC（邻苯二甲醛和9－芴甲基氯甲酸酯）法等。前4种方法需手工衍生，反应活性差、速度慢且易受试剂干扰。OPA－FMOC法可克服上述缺点，应用广泛［5－6］

本文采用邻苯二甲醛（OPA）与一氯甲酸芴甲酯（FMOC）联用全自动柱前衍生化高效液相色谱法建立了太子参中精氨酸的含量测定方法。分离效果好，谱图重现性好，分析和检测结果令人满意，可推广应用于中药材中氨基酸类成分含量测定。

1 仪器与试药

Agilent1100系列高效液相色谱仪；DAD检测器；精氨酸对照品（批号：024－201004，由中国食品药品检定研究院提供），一氯甲酸芴甲酯（FMOC）（批号：FA120119，购自LANCASTER公司）；乙腈、甲醇、四氢呋喃为色谱纯，其他试剂均为分析纯。太子参药材来自福建、湖南、安徽，经上海市食品药品检验所季申主任药师鉴定。

表1 太子参产地及编号

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Hypersil ODS色谱柱（4.6mm×200mm，5μm）色谱柱；柱温25℃；流动相为A：B（92：8），A为醋酸钠溶液（取0.272%醋酸钠溶液1000mL，加三乙胺0. 2mL，四氢呋喃6mL，用2%醋酸溶液调节pH值至7.20），B为13.6%醋酸钠溶液（用2%醋酸溶液调节pH值至7.20）－乙腈－甲醇（40：70：90）；检测波长为338nm；流速1.0mL／min。

在上述色谱条件下，供试品中精氨酸与其它色谱峰分离度良好。为确保定量分析的准确性，在系统适用性实验中精氨酸理论塔板数不得低于5000。见图1。

图1 HPLC色谱图

2.2 供试品溶液的制备 取本品粉末（过三号筛）1g，精密称定，精密加入0.1mol／L盐酸－乙醇（9：1）混合溶液20mL，称定重量，加热回流1h，放冷，再称定重量，溶入0.1mol／L盐酸－乙醇（9：1）混合溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3 对照品溶液的制备精密称取精氨酸对照品适量，加0.1mol／L盐酸－乙醇（9：1）混合溶液制成1.2mg／mL的溶液，即得。

2.4 衍生化试剂的配制 0.4 mol／L硼酸缓冲液（pH10.2）：取硼酸，配制成0.4 mol／L的溶液，用40%氢氧化钠溶液调节pH值至10.2，即得（冷藏）。1%邻苯二甲醛（OPA）溶液：称取邻苯二甲醛（OPA）80mg，加硼酸缓冲液（pH10.2）7 mL，乙腈1mL，巯基丙酸125μL，混匀，即得（冷藏）。0.5%一氯甲酸芴甲酯（FMOC）溶液：称取一氯甲酸芴甲酯（FMOC）50mg，用乙腈适量使溶解，并稀释至10mL即得（冷藏）。

2.5 标准曲线的绘制 精密称取精氨酸对照品适量，加0.1mol／L盐酸－乙醇（9：1）混合溶液制成浓度为20mg／m L的对照品贮备溶液。精密量取对照品贮备溶液适量，加0.1 mol／L盐酸－乙醇（9：1）混合溶液，分别稀释成0.2、0.4、0.8、1.2、2、4 mg／mL的溶液，作为对照品溶液，分别进样1μL，记录峰面积，以峰面积为纵坐标Y，进样量（μg）为横坐标X，绘制标准曲线，结果回归方程为：Y＝1859.4X＋2.0015（r＝0.9999），在0.2～4μg与峰面积呈良好的线性关系。

2.6 重复性试验 取本品粉末（TZS－2，过三号筛）1g，一式6份，按照上述条件测定，计算含量和RSD，结果精氨酸含量为24.60、24.84、25.32、25.15、25.78、25.15 mg／g，RSD为1.6%。

2.7 稳定性考察 取同一供试品溶液，分别于0、2.5、5、7.5、10、12、24h测定，记录精氨酸的峰面积，计算RSD（n＝6）为0.87%，表明供试品溶液在24h内基本稳定。

2.8 回收率试验 取本品粉末（TZS－2，过三号筛）0.5 g，精密称定，一式9份，分别精密加入15.182 mg／mL的精氨酸对照品溶液0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL（各3份），再分别精密加入0.1 mol／L盐酸－乙醇（9：1）混合溶液20 m L，称定重量，加热回流1h，放冷，再称定重量，溶入0.1 mol／L盐酸－乙醇（9：1）混合溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液即得，结果见表2。

表2 加样回收率试验测定结果（n＝9）

2.9 样品测定 取各批样品，按供试品溶液的制备方法分别制备供试品溶液，测定精氨酸的含量，结果见表3。结果表明，不同产地，不同批次的太子参的精氨酸含量有一定的差异。

表3 样品测定结果

3 讨论

采用柱前衍生化高效液相色谱法测定太子参中精氨酸的含量，操作简单，衍生化完全，可作为衡量太子参中氨基酸含量水平的一个有效评价方法。含量分析表明，太子参药材中精氨酸的含量较高，但不同产地来源，不同批次药材中精氨酸的含量存在一定差异，反映出了太子参药材的质量差异。精氨酸的含量可以作为太子参质量评价的一个指标。

试验考察了338、280、262、230、210nm波长下色谱峰的情况，结果在210nm下基线漂移严重，262、230、280 nm下所得色谱图中衍生化试剂的紫外吸收较大，338nm为精氨酸的次最大吸收波长，且在该波长下衍生化试剂吸收很小，因此选择338nm作为检测波长。

氨基酸的提取一般选用水或0.1 mol／L盐酸溶液，考虑到富氨基酸的水溶液易长菌，宜加入一定量的乙醇。试验考察了水、0.1mol／L盐酸溶液、0.1mol／L盐酸－乙醇（9：1）混合溶液和30%乙醇溶液，结果发现0.1mol／L盐酸－乙醇（9：1）混合溶液的提取率较高，杂质较少。故选择0.1mol／L盐酸－乙醇（9：1）混合溶液作为提取溶剂。

为得到最佳的供试品提取方法，试验比较了超声处理1h和加热回流1 h，结果加热回流的提取效率较高，首先确定了加热回流的提取方式。再分别考察了不同的加热回流时间（0.5、1、2、3 h）的提取效率，结果不同提取时间的提取效率基本一致，因此确定供试品提取方法为加热回流1h。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）［M］.北京：中国医药科技出版社，2010.

［2］刘训红，阚毓铭.太子参研究概述［J］.时珍国医国药，2000，11（12）：1131.

［3］吴朝峰，林彦铨.药用植物太子参的研究进展［J］.福建农林大学学报，2004，33（4）：426.

［4］韩邦兴，朱志祥，姚勇，等.不同产地太子参多糖、氨基酸含量比较分析［J］.中成药，2010，32（3）：513.

［5］丁永胜，牟世芬.氨基酸的分析方法及其应用进展［J］.色谱，2004，22（3）：210.

［6］陈稚，陈波，揭新明，等.邻苯二甲醛柱前衍生反相高效液相色谱法检测珍珠粉中的氨基酸含量［J］.时珍国医国药，2007，18（7）：1680.

［7］王文凯，贾静，丁仁伟，等.太子参近年研究概况［J］.中国实验方剂学杂志，2011，17（12）：264.

［8］安坤，何静，万忠民，等.不同产区太子参氨基酸含量测定及多元统计分析［J］.天然产物研究与开发，2012，24（5）：594.

［9］陈鹭颖.OPA－FMOC联用柱前衍生法测定复方氨基酸注射液中氨基酸的含量［J］.海峡药学，2001，13（4）：26.

［10］陈健，姚成.柱前衍生化RP－HPLC测定中药野马追中的氨基酸［J］.林产化工通讯，2003，37（5）：7.

［11］苏建坤，王雪，卢建秋，等.OPA－FMOC在线衍生化法测定氨基酸的含量［J］.中国实验方剂学杂志，2012，18（15）：135.

Pre－column derivatization RP－HPLC determ ination of arginine inPseudostellaria heterophy lla

Wang XinmeiWang Ke Ji Shen
Shanghai Institute for Food and Drug Control，Shanghai，201210

ObjectiveAn Pre－column derivatization RP－HPLCmethod was developed to analyze arginine in Pseudostellaria heterophylla.M ethod：The samples were extracted with 0.1mol／L hydrochloride acid－alchohol（9：1）solution.The Extracts were pre－columnly derived with o－phthaldialdehyde（OPA）and fluorenylmethyl chloroformate（FMOC）and determined at338nm.Result：The calibration curve was in good linearity with in the range from0.2～4μg（r＝0.9999.The average recovery was 101.2（n＝6）.Conclusion：The method is simple，sensitive，accurate with high repeatability and stability，short－time－consum ing，which is applicable to the testing ofarginine in Pseudostellariaheterophylla.The contentarginine varied from cultivated placesand batches.

Pseudostellaria heterophylla（Miq.）Pax；arginine；Pre－column Derivatization；HPLC

R927

A

1007－8517（2013）19－0007－03

2013.07.23）