冬虫夏草在大鼠离体肝脏保存中的实验研究

张佳伟 黄建钊 赵鹏伟 刘江伟

贵州省人民医院肝胆外科，贵州 贵阳 550002

冬虫夏草在大鼠离体肝脏保存中的实验研究

张佳伟 黄建钊 赵鹏伟 刘江伟

贵州省人民医院肝胆外科，贵州 贵阳 550002

目的：研究冬虫夏草对离体大鼠肝脏低温保存损伤的保护作用。方法：采用大鼠肝脏离体非循环灌注模型（IPRL），在乳酸林格氏液（LR液）中加入不同剂量冬虫夏草对离体大鼠肝脏保存12h，记录胆汁流出量，测定灌注流出液AST、ALT、LDH和氧自由基代谢产物丙二醛（MDA）的含量，观察肝脏组织形态学变化。结果：冬虫夏草组（900mg·L－1）的胆汁分泌（172.95±12.7）μl明显高于保存对照组（98.68±5.5）μl（P＜0.01），冬虫夏草组（900mg·L－1）灌出液中丙二醛（7.68±0.647）nmol·mL－1、丙氨酸转氨酶（ALT）（41.53±11.6）U·L－1、门冬氨酸转氨酶（AST）（38.87±12.66）U·L－1及乳酸脱氢酶（LDH）（191±21.8）U·L－1明显低于保存对照组（9.49±0.65）nmol·mL－1、（236.12±94.5）U·L－1、（145.12±81.56）U·L－1及（540.37±176.9）U·L－1，有显著性差异（P＜0.01）。结论：冬虫夏草可明显的提高大鼠离体肝脏的保存效果，作用机理与提高肝细胞抗氧自由基能力、维持细胞膜功能、减少线粒体损伤、改善肝脏微循环的作用有关。

器官保存；冬虫夏草；大鼠；再灌注损伤

我们采用大鼠肝脏离体非循环灌注模型，观察乳酸林格氏液（LR液）中加入不同剂量冬虫夏草后保存大鼠肝脏的效果，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 采用健康、成年、清洁级SD大鼠（编号：scxk（黔）2002－0001）48只，体重350～400g，雌雄不限，购于贵阳医学院实验动物中心。

1.2 动物分组 根据保存时间及LR液内虫草剂量的不同，把SD大鼠随机分为6组，每组8只，保存温度为2～4℃。非保存组（不含虫草，保存时间0h）；保存对照组（不含虫草，保存时间12h）；A组（含300mg·L－1虫草，保存时间12h）；B组（含600mg·L－1虫草，保存时间12h）；C组（含900mg·L－1虫草，保存时间12h）；D组（含1200mg· L－1虫草，保存时间12h）。

1.3 动物模型 大鼠非循环离体灌注模型的制备［1］：大鼠禁食12h，腹腔注射3%戊巴比妥钠麻醉，仰卧固定。取腹部“十”字切口进腹。经下腔静脉注入25U·mL－1肝素生理盐水2mL。解剖肝门部，游离门静脉、胰胆管。距肝门1cm处分别置管、固定。在右肾平面上切断肝下下腔静脉，经门静脉管以5mL·min－1原位灌注4℃的LR液30min，肝脏变为土黄色后连同部分膈肌切取，置于2～4℃保存液中保存12h。各组保存结束后，再经门静脉管以15m L·min－1恒温37℃灌注LR液30min，灌注中持续通入95%O2与5% CO2混合气体及20μmol·L－1牛磺胆酸钠（非保存组不保存，肝脏切取后直接灌注）。

1.4 检测指标及方法 ①胆汁分泌量的测定：灌注中通过胰胆管采集离体肝脏分泌的胆汁。②流出液AST、ALT及LDH的测定：离体灌注最后2min，取灌注流出液2mL。用全自动生化分析仪测定AST、ALT及LDH的值。③流出液MDA的测定：离体灌注最后2min，取灌注流出液5mL，以3000r／min离心5min，取上清液，置于－40℃低温冰箱保存待测。用ELISA法测定MDA含量。④肝脏病理组织损伤程度的比较：取肝中叶组织约1.0cm×0.5cm×0.5cm于10%中性甲醛溶液中固定，经H－E染色，在放大100倍光镜下采观察肝细胞水变性、肝细胞气球样变性、肝细胞脂肪变性、肝细胞嗜酸变性、肝细胞嗜酸性坏死、肝细胞液化坏死、肝淤血、炎细胞浸润。无该病变0分，出现该病变至占组织块30%以下1分，占组织块30%～50%2分，占组织块50%以上3分。大鼠肝脏的损伤度通过评分方式来表示。

1.5 统计学方法 所有数据应用SPSS17.0软件进行处理，实验结果以均值±标准差（±s）表示，采用方差分析，P＜0.05有差异，P＜0.01有极显著差异。

2 结果

2.1 各组大鼠胆汁分泌量、灌出液丙二醛（MDA）含量及肝脏HE染色病理损伤评分见表1

表1 各组大鼠胆汁分泌量、灌出液丙二醛（MDA）含量及肝脏HE染色病理损伤评分的比较（±s）

表1 各组大鼠胆汁分泌量、灌出液丙二醛（MDA）含量及肝脏HE染色病理损伤评分的比较（±s）

说明：＃：与非保存组比较P＜0.05；＃＃：与非保存组比较P＜0.01。*：与保存对照组比较P＜0.05；**：与保存对照组比较P＜0.01。Δ：与A组比较P＜0.05；ΔΔ：与A组比较P＜0.01；Ο：与B组比较P＜0.05；ΟΟ：与B组比较P＜0.01；◎：与C组比较P＜0.05；◎◎：与C组比较P＜0.01，无图标表示无差异。

实验动物分组非保存组（n＝8）保存对照组（n＝8）A组（n＝8）B组（n＝8）C组（n＝8）D组（n＝8）汁分泌量（μl）223.05± 17.7**ΔΔΟΟ◎◎98.68±5.552＃＃ΔΔΟΟ◎◎157.12±12.39＃＃**◎152.38±9.37＃＃**◎◎172.95±12.7＃＃**ΔΟΟ156.5±12.39＃＃**◎灌出液MDA含量（nmol·m l－1）5.73±0.854**ΔΔΟΟ◎◎9.49±0.651＃＃**ΔΔΟΟ◎◎8.44±0.38＃＃**◎8.38±0.539＃＃**◎7.68±0.647＃＃**ΔΟ7.18±0.84＃＃**ΔΔΟΟ肝脏损伤度评分0.25±0.46**ΔΔΟΟ◎◎6.5±1.41＃＃ΔΟΟ◎◎4.875±1.45＃＃*4.5±1.6＃＃**4.62±1.5＃＃**4.75±1.0＃＃*

2.2 各组灌注流出液AST、ALT及LDH测定见表2

表2 为各组大鼠灌出液ALT、AST、LDH的比较（±s）

表2 为各组大鼠灌出液ALT、AST、LDH的比较（±s）

说明：＃：与非保存组比较P＜0.05；＃＃：与非保存组比较P＜0.01。*：与保存对照组比较P＜0.05；**：与保存对照组比较P＜0.01。Δ：与A组比较P＜0.05；ΔΔ：与A组比较P＜0.01；Ο：与B组比较P＜0.05；ΟΟ：与B组比较P＜0.01；◎：与C组比较P＜0.05；◎◎：与C组比较P＜0.01，无图标表示无差异。

实验动物分组非保存组（n＝8）保存对照组（n＝8）A组（n＝8）B组（n＝8）C组（n＝8）D组（n＝8）灌出液ALT（U·L－1）9.37±5.8**ΔΔΟΟ◎◎236.12±94.5＃＃ΔΔΟΟ◎◎77.73±22.9＃＃**◎◎69.37±20.2＃＃**◎◎41.53±11.6＃＃**ΔΔ○○73.25±19.2＃＃**◎◎灌出液AST（U·L－1）14.25±6.77**ΔΔΟΟ◎◎145.12±81.56＃＃ΔΔΟΟ◎◎55.75±14.29＃＃**◎59.75±23.51＃＃**◎38.87±12.66＃＃**ΔΟ57.1±14.4＃＃**◎灌出液LDH（U·L－1）30.25±27.4**ΔΔΟΟ◎◎540.37±176.9＃＃ΔΔΟ◎◎Ο297.25±71.5＃＃**◎◎282.875±39.4＃＃**◎◎191±21.8＃＃**ΔΔΟΟ201±27.1＃＃**ΔΔΟΟ◎◎

2.3 各组大鼠肝脏HE染色图1－6

3 讨论

冬虫夏草是一种常用的药用虫生真菌，属肉座菌目麦角菌科虫草属植物。其活性成分包括核苷类化合物、甾醇类、多糖类、超氧化物歧化酶（SOD）、多种氨基酸、多种维生素及矿物质元素等。它不但具有增强免疫应答、抑制肿瘤细胞生长、抗炎抗病毒、保护肝肾功能、改善心血管功能、预防高血糖等功效，还具有强大的抗氧自由基损害、保护细胞膜及线粒体损伤的功能［2－4］。

研究表明冬虫夏草提高肝组织对抗脂质过氧化，减轻细胞膜及线粒体的损伤与SOD、D－甘露醇及粘多糖的存在有密切关系。叶博［5］认为SOD是体内自由基清除系统内一个重要抗过氧化酶，作用是催化超氧阴离子生成H2O2，从而阻断毒性更强的羟自由基产生。又是超氧阴离子的底物诱导酶，保护细胞免遭有氧代谢物的损伤。在维护机体活性氧代谢的平衡中起重要作用。口如琴［6］发现冬虫夏草中含有SOD，活性高达340U／g干重，可显著提高脏器中抗氧化酶活力，降低B型单胺氧化酶活力和减少MDA含量。路海东等［7］通过实验证实冬虫夏草对组织中过氧化物脂质的生成有明显的对抗作用，具有良好的抗氧化作用。

D－甘露醇是HFR的特异性清除剂，而所含虫草素对SAFR有清除作用，它们共同作用于机体产生的自由基，防止自由基对细胞膜的攻击，保护膜功能的稳定；冬虫夏草中粘多糖与细胞相互作用，在膜表面形成了一层糖屏障，有效地防止机体缺氧时肝组织细胞膜脂质流动性的降低，保护细胞膜上Na、K－ATP酶活性，维持细胞膜功能，从而防止细胞受到氧自由基的损伤［8］。张藿等［9］通过建立糖尿病模型，来阐明了冬虫夏草对糖尿病小鼠肝线粒体氧化损伤的保护效应。

关于肝移植保存－再灌注损伤的发生机制，现尚未完全阐明，但其与氧自由基损伤、细胞膜及线粒体损伤密切相关。故我们探讨具有抗氧自由基损伤、保护细胞膜及线粒体的中药冬虫夏草用于离体肝脏研究。本实验结果显示，LR液中加入冬虫夏草后的A、B、C、D组，胆汁的分泌量明显高于保存对照组。冬虫夏草浓度为0～900mg·L－1时，胆汁的分泌量与冬虫夏草的剂量呈正相关。ALT、AST及LDH能反映肝细胞的损伤程度，间接反映肝脏再灌注的微循环情况，实验结果表明，含有冬虫夏草的A、B、C、D组AST、ALT及LDH值均小于保存对照组，且冬虫夏草浓度为900mg·L－1时降低最明显。故我们认为冬虫夏草可维持细胞膜功能、降低大鼠肝细胞的损伤，并对肝脏的微循环及肝细胞胆汁分泌功能的保护是有效的。MDA为氧自由基的代谢产物，可直观的反映肝脏抗氧自由基的能力。实验结果表明，肝脏保存12h后的保存对照组MDA含量明显高于肝脏未保存组，而含冬虫夏草的A、B、C、D组MDA含量则显著低于保存对照组（P＜0.01），浓度为900mg·L－1与浓度为1200mg·L－1时降低最明显，两组之间无明显差异。这与大鼠肝细胞损伤及胆汁分泌功能的变化是一致的。从肝脏H－E染色的病理损伤来看，含有冬虫夏草的A、B、C、D组的损伤程度较保存对照组轻，且冬虫夏草组内各浓度无明显差异。

因此，LR液中加入冬虫夏草可明显提高供体肝脏的保存效果。我们认为，冬虫夏草的作用机理是多方面的，但它提高供肝保存质量的机理可能主要与提高肝细胞抗氧自由基能力，维持细胞膜功能，减少线粒体损伤，改善肝脏微循环的作用有关。

［1］李立，李春满，等.自制KYL液和UW液保存大鼠肝脏效果的比较，［J］.中国普外基础与临床杂志，2005，12（4）：375－379.

［2］顾宇翔，宋聿文，范立强，等.虫草及其发酵制品抗氧化能力研究［J］.中国中药杂志，2007，32（11）：1028－1031.

［3］张藿，陈顺志，刘树森.冬虫夏草提取液对糖尿病小鼠肝线粒体氧化损伤的保护效应［J］.中国临床康复，2006，10（39）：132－134.

［4］张敏玲.冬虫夏草对运动小鼠肝组织自由基代谢及血清酶活性的影响［J］.西安体育学院学报，2005，22（6）：70－72.

［5］叶博.北虫草药理作用研究，［J］.安徽农学通报，2009，15（9）：52－54.

［6］口如琴.虫草真茵棒束孢霉的营养成分及其延缓衰老的作用，［J］.营养学报，1995，（4）：3415.

［7］路海东，王惠娟，侯大平.冬虫夏草脂质体口服液抗脂质过氧化作用，［J］.黑龙江医药科学，2002，25（4）：42.

［8］张敏玲.冬虫夏草对运动小鼠肝组织自由基代谢及血清酶活性的影响［J］.西安体育学院学报，2005，22（6）：70－72.

［9］张藿，陈顺志，刘树森.冬虫夏草提取液对糖尿病小鼠肝线粒体氧化损伤的保护效应［J］.中国临床康复，2006，10（39）：132－134.

Effect of Cordyceps on preserved ex vivo rat liver

Objective：To study the protective effect of Cordyceps on cryopreservation injury of ex vivo rat liver。Methods：U-sing the non－circulated isolated perfusion of rat liver，the preservation effects o Lactate Ringer’s（LR）solution containing Cordycepswith differentdoseswere compared.After the rat liverswere preserved for12h in LRsolution with the addition of Cordyceps，measuring the bile production，the contents of AST、ALT、LDH and MDA in LR’s perfusate，observing themorphological changes in liver and for liver pathology injury score.Results：the Cordyceps group（900mg·L－1）bile secretion areas（172.95±12.7）μl were greater than the preserved control group（98.68±5.5）μl（P＜0.01），the Cordyceps group（900mg·L－1）the contents of MDA（7.68±0.647）nmol·mL－1、ALT（41.53±11.6）U·L－1、AST（38.87±12.66）U·L－1and LDH（191±21.8）U ·L－1in perfusate were lower than the preserved control group（9.49±0.65）nmol·mL－1、（236.12±94.5）U·L－1、（145.12 ±81.56）U·L－1and（540.37±176.9）U·L－1，have significant difference（P＜0.01）Conclusion：The Cordyceps solution is improved the effectof the rat liver preservation，mechanism of action：Improve the ability resist oxygen free of liver cells，preserve the function of cellmembrane，reducemitochondrial damage，improve livermicrocirculation effects.

Organ Preservation；Cordyceps sinensis；rat；reperfusion injury

R285.5

A

1007－8517（2013）02－0012－03

2012.11.25）

。贵州省中医药管理局中医药、民族医药科学技术研究专项（黔中医药发（2007）35号）。

张佳伟（1984－），男，山西省蒲县人，遵义医学院医学硕士，肝胆外科专业，住院医师；赵鹏伟（1984－），男，山西省隰县人，遵义医学院医学硕士，肝胆外科专业，住院医师。

黄建钊，教授，主任医师，华中科技大学同济医院器官移植研究所博士后出站，硕士生导师，肝胆外科专业，科主任。