卟啉为核的星形聚己内酯-嵌段-聚乙二醇的合成及释放性能

黄雅菲，戈延茹，戚雪勇，戴晓晖

(江苏大学1.药学院，2.化学化工学院，江苏 镇江 212013)

卟啉类化合物存在大π共轭结构，在紫外可见区有强吸收，对光具有良好的灵敏性，而且具有肿瘤靶向性，对正常组织毒性小，可作为抗肿瘤光动力治疗(photodynamic therapy，PDT)的光敏剂［1］。但传统的小分子卟啉存在较强的π－π及疏水相互作用，在生物体内形成聚集体，造成其光量子效率低，即发生光自淬灭。因此，以卟啉为内核，通过高分子功能化，再利用高分子自组装，获得含卟啉药物核的靶向型高分子纳米微粒，有望高效地把高浓度的光敏药物递送到病灶部位［2－4］。

我们以四(4-羟乙基苯基)卟啉为引发剂，通过开环聚合和酯化反应制备了卟啉为核的星形聚己内酯-嵌段-聚乙二醇［star-shaped porphyrin-cored poly(caprolactone)-block-poly(ethylene glycol)，SPPCL-b-PEO］。在该共聚物分子中，四臂大分子骨架可有效延缓卟啉内核的自淬灭，在临床癌症治疗中，能极大限度保留卟啉内核的光动态疗效。而且亲水聚乙二醇(polyethylene glycol，PEO)链段能有效改善疏水聚己内酯(poly caprolactone，PCL)链段的高结晶度和疏水性［5－6］。这些特性使得该共聚物载药纳米微球满足靶向给药系统的要求。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

四(4-羟乙基苯基)卟啉的制备依照文献［7－9］。单甲氧基聚乙二醇(monomethoxy polyethylene glycol，MPEO，Aldrich，Mn=2000/5000)、4-二甲氨基吡啶(4-dimethylaminopyridine，DMAP，Aldrich)、双环己基碳酰亚胺(dicyclohexylcarbodiimide，DCC，上海国药集团)真空干燥8 h后使用;异辛酸亚锡(SnOct2，Aldrich)、琥珀酸酐(succine anhydride，上海国药集团)、1，4-二氧六环(1，4-dioxane，上海国药集团)直接使用;ε-己内酯(ε-caprolactone，百灵威科技有限公司)、甲苯(toluene，上海国药集团)减压蒸馏后使用;二氯甲烷(CH2Cl2，上海国药集团)、三乙胺(上海国药集团)加CaH2回馏12 h后蒸出。其他所有溶剂未经说明均不作任何处理。

凝胶渗透色谱(gel permeation chromatograph，GPC)由配有2根Mixed-B柱子(Polymer Lab公司，孔径10 μm，柱子尺寸为300 mm×7.5 mm)的 Perkin-Elmer Series 200凝胶渗透色谱仪(美国铂金埃尔默公司)测得;核磁共振谱(nuclear magnetic resonance spectrum，NMR)由Varian Mercury-400核磁共振谱仪(美国瓦里安公司)测得;红外光谱(fourier transform infrared spectroscopy，FT-IR)由 Nicolet Nexus 470傅里叶变换红外光谱仪(美国尼高力公司)测得;紫外可见光谱(ultraviolet visible spectroscopy，UV-vis)由N-2450高效紫外可见分光光度计(日本岛津公司)测得;荧光激发光谱由Varian Cary Eclipse荧光分光光度计(美国瓦里安公司)测得;透射电镜(transmission electron microscope，TEM)照片由 JEOL JEM-2100透射电子显微镜(日本电子公司)拍摄。

1.2 实验方法

1.2.1 共聚物的合成

1.2.1.1 卟啉为核的星型聚己内酯［porphyrincored star-shaped poly(caprolactone)，SPPCL］的合成SPPCL24(聚合度和分子质量的值见表1)的合成方法依照我们以前的文献报道［10］。加 入 ε-CL(309 mg，2.71 mmol)和四(4-羟乙基苯基)卟啉(19.5 mg，0.023 mmol)于干燥的试管中，用翻口塞封口，抽真空通氮气3次后放入120℃恒温油浴锅中磁力搅拌5 min，再用微量进样器加入含SnOct2(1.1 mg，2.75 μmol)的甲苯溶液，120 ℃ 下磁力搅拌反应24 h。将试管冷却至室温，所得固体溶解于2 mL的CH2Cl2中，然后沉降于100 mL冰甲醇中。过滤后所得产物，在40℃下真空干燥至恒重。产量316.4 mg，产率96.3%。

1.2.1.2 端羧基化聚乙二醇(carboxyl-terminated monomethoxy polyethylene glycol，CMPEO)的合成制备过程依照文献［11－12］，以CMPEO2000的合成为例。称取 MPEO(Mn=2 000，2.0 g，1.0 mmol)，丁二酸酐(152.4 mg，1.5 mmol)，DMAP(123.2 mg，1.0 mmol)溶解于10 mL无水1，4-二氧六环中，然后加入三乙胺(140 μL，1.0 mmol)，室温下搅拌反应24 h。反应混合液旋转蒸发掉溶剂，将固体溶于少量CH2Cl2中，然后搅拌下逐滴沉降于100 mL冰乙醚中，产物过滤后，40℃下真空干燥至恒重。产量1.61 g，产率85.5%。

1.2.1.3 卟啉为核的星型聚己内酯-嵌段-聚乙二醇(SPPCL-b-PEO)的合成 SPPCL-b-PEO是通过SPPCL 和 CMPEO 发生酯化反应合成的［11－12］。以SPPCL24-PEO5000的合成为例，称取 SPPCL24(Mn=11 356，113.6 mg，0.01 mmol)，CMPEO 5 000(Mn=5 000，225.0 mg，0.045 mmol)，DCC(16.3 mg，0.08 mmol)和 DMAP(1.9 mg，0.015 mmol)溶解于2.0 mL无水CH2Cl2中，室温氮气流下搅拌反应24 h。旋转蒸发掉溶剂，将残渣溶于适量 CH2Cl2中，然后沉降于冰乙醚中，过滤得粗产物。粗产物使用乙醚和苯混合溶液(2∶1，mol∶mol)纯化，所得产物40℃下真空干燥至恒重。产量235.8 mg，产率75.2%。

1.2.2 大分子骨架对卟啉核的屏蔽效应研究 依据文献［13－15］，将 1，3-二苯基异苯并呋喃(1，3-diphenylisobenzofuran，DPBF)配制成浓度为 10－6mol/L的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液，同时将样品四(4-羟基苯基)卟啉(THPPH2)、SPPCL24、SPPCL24-PEO5000分别配制成浓度为1.5×10－4mol/L的DMF溶液。取5 μL上述样品溶液加入到5 mL上述DPBF溶液中，立即测定混合溶液在激发波长(Ex)403 nm处的荧光激发光谱并记录其荧光强度。然后用激光对其照射300 s，期间每30 s测定1次上述Ex处的荧光激发光谱并依次记录相应荧光强度。

1.2.3 SPPCL-b-PEO共聚物自组装胶束的制备所有样品的胶束溶液用透析法制备。具体操作如下:4 mg共聚物样品溶解于1 mL DMF中，磁力搅拌下，用微量进样器将该溶液以10 μL/min的速度逐渐滴加到2 mL蒸馏水中，在室温下继续搅拌24 h使制备的聚集体平衡，然后装入透析袋(截留分子质量为7 000)，在1 L的蒸馏水中透析72 h除去DMF，每隔12 h换水1次。

1.2.4 药物包载与释放

1.2.4.1 多柔比星载药纳米微球的制备 用透析法制备负载多柔比星的SPPCL-b-PEO纳米微球，制备方法参考文献［16－17］。称取10.0 mg SPPCL24-PEO5000溶解于 6.5 mL DMF，称取 2 mg(3.4 μmol)盐酸多柔比星(DOX-HCl)溶解于1 mL DMF并加入1.5倍当量(5.1 μmol)的三乙胺中和，一段时间后，将两溶液混合搅拌片刻。向溶液中滴加10 mL的磷酸盐缓冲液(0.1 mol/L，pH 8.4)，搅拌24 h。将混合溶液装入透析袋(截留分子质量为7 000)，在1 L的蒸馏水中透析72 h，每12 h换水1次，除去DMF。最后通过冷冻干燥得到载药纳米粒子冻干粉。

1.2.4.2 包封率和载药量的测定 称取载药胶束冻干粉1 mg溶于10 mL DMF中，通过UV-vis测定载药量和包封率。多柔比星的检测波长为500 nm，对应的标准曲线:D=0.020 2C+0.0037(R=0.999 8)。胶束的载药量和包封率分别按以下公式计算:载药量=微球中所含的药量/微球的总质量×100%;包封率=微球中所含的药量/投入的总药量×100%

1.2.4.3 负载多柔比星的SPPCL-b-PEO纳米微球的体外释放参考文献［16-17］，将2 mg的负载多柔比星的SPPCL24-PEO5000纳米微球溶解于2 mL PBS缓冲溶液 (pH 7.4/5.6)，然后放入透析袋中(截留分子质量为7 000)，将透析袋浸入装有10 mL PBS缓冲溶液的小瓶中，37℃下恒温振荡进行释放。每隔一定时间取出1 mL PBS溶液，并加入1 mL新的PBS溶液。用UV-vis分别测得不同时间点所取溶液的光密度，通过标准曲线计算各时间点多柔比星的浓度，由以下公式计算累积释药量:

Er:多柔比星累积释放量(%);Ve:PBS溶液的置换体积，1 mL;Ci:第i次置换取样时释放液中药物的质量浓度(μg/mL);V0:PBS释放液的总体积，12 mL;mdrug:载药胶束中多柔比星的质量(μg);n:PBS溶液的置换次数;Cn:第n次置换取样时释放液中药物的质量浓度(μg/mL)。

2 结果

2.1 SPPCL-b-PEO嵌段共聚物的合成

一系列的SPPCL-b-PEO共聚物通过两步反应得到。首先，四(4-羟乙基苯基)卟啉在SnOct2催化下，引发ε-CL单体的开环聚合(ring-opening polymerization，ROP)得到了结构规整的星型端羟基聚己内酯(SPPCL-OH)。然后，室温下SPPCL-OH的末端羟基与CMPEO的末端羧基在DMAP/DCC催化体系下，直接发生酯化缩聚反应生成了SPPCL-b-PEO。合成路线见图1所示，n和m分别表示共聚物中PCL链段的重复单元数和PEO链段的相对分子质量。

图2是SPPCL和SPPCL-b-PEO的GPC曲线，均得到狭窄的单峰，随着相对分子质量增加，峰值向短流出时间方向移动，说明反应具有良好的可控性。由GPC测定的聚合物的数均分子质量Mn，GPC大于其理论相对分子质量Mn，th(表1)，可能是因为星形聚合物的流体力学体积与作为标样的线性聚苯乙烯不一样引起的［18－19］。

图3(1)为聚合物SPPCL的1H NMR谱图，很明显，位于 δ1.35 ～1.45(δH3)、δ1.55 ～1.79(δH2)、δ2.28 ～2.43(δH1)和 δ4.05 ～4.19(δH4)处出现了归属于PCL重复单元的典型质子峰，位于 δ4.48(δH13)、δ4.64(δH12)、δ7.52(δH9)、δ8.11(δH10)和δ9.21(δH11)处出现了归属于卟啉核的典型质子峰。除此之外，δ3.68处还出现了PCL链段末端的羟基亚甲基(HOCH2)的质子信号峰(δH5)，该峰与卟啉核中任意质子峰的积分面积之比均近似于1。这些都证明了在SnOct2催化下，四(4-羟乙基苯基) 卟啉能够有效引发ε-己内酯单体的本体开环聚合。

图1 SPPCL-b-PEO共聚物的合成路线Fig 1 Synthesis of SPPCL-b-PEO copolymers

表1 SPPCL和SPPCL-b-PEO制备参数和相对分子质量Tab 1 Preparation parameters and molecular weight data for SPPCL and SPPCL-b-PEO

图2 SPPCL和SPPCL-b-PEO的GPC曲线Fig 2 GPC traces of SPPCL and SPPCL-b-PEO

SPPCL的实际分子质量(Mn，NMR)与理论分子量Mn，th的值基本符合，具体值见表1。与SPPCL比较，共聚物SPPCL-b-PEO的1H NMR［图3(2)］中出现了几个新的质子峰 δ2.67(δH6)、δ3.66(δH7)、δ3.39(δH8)。δH7和 δH8分别为 PEO 中重复单元和末端甲氧基(—OCH3)的质子峰，δH6属于共聚物PCL和 PEO连接处的亚甲基(—CH2—)质子峰。PCL链段的端基信号峰(δH5)在SPPCL-b-PEO中完全消失了。比较SPPCL和SPPCL-b-PEO的13C NMR(图4)，SPPCL-b-PEO 在 δ29.2和 δ70.3处分别出现了新的峰δhC和δiC，这些都是SPPCL-b-PEO的特征峰，而属于 SPPCL的端基碳信号δgC(δ60.1)完全消失了。SPPCL-b-PEO 的 Mn，NMR与 Mn，th基本一致，具体值见表1。这些说明该反应有效合成了SPPCL-b-PEO。

图5是聚合物SPPCL、CMPEO及共聚物SPPCL-b-PEO的FT-IR图谱，可观察到在1 734 cm－1和2 952 cm－1处分别出现了PCL的羰基(C==O)伸缩振动峰和甲基(—CH3)/亚甲基(—CH2—)伸缩振动峰。位于1 104 cm－1和2 882 cm－1处的信号峰分别归属于PEO中的醚键(O—C—O)和亚甲基(—CH2—)。此外，随着PEO嵌段的接入及长度的增加，羰基和甲基/亚甲基的峰信号逐渐减弱。

图3 SPPCL(1)和 SPPCL-b-PEO(2)在 CDCl3中的1H NMR图谱Fig 3 1H NMR spectra of SPPCL(1)and SPPCL-b-PEO(2)in CDCl3

图4 SPPCL(1)和 SPPCL-b-PEO(2)在 CDCl3中的13C NMR图谱Fig 4 13C NMR spectra of SPPCL(1)and SPPCL-b-PEO(2)

图5 SPPCL，CMPEO和SPPCL-b-PEO的FT-IR图谱Fig 5 FT-IR spectra of SPPCL，CMPEO and SPPCL-b-PEO

图6是THPPH2、SPPCL24、SPPCL24-PEO5000在DMSO中和SPPCL24-PEO5000纳米微球在H2O中的UV-vis图谱，均在435 nm处出现B(soret)吸收和Q(500～700 nm)带吸收，这些都属于卟啉化合物典型的紫外吸收［10，20］。这表明 SPPCL 和 SPPCL-b-PEO仍然保留了卟啉的发光性能。这一潜在性能使SPPCL和SPPCL-b-PEO可作为生物探针和PDT光敏剂被应用。

图 6 THPPH2、SPPCL24、SPPCL24-PEO5 000在 DMSO中和SPPCL24-PEO5 000纳米微球在H2O中的UV-vis谱图Fig 6 UV-vis spectra of THPPH2，SPPCL24，SPPCL24-PEO5 000in DMSO and SPPCL24-PEO5 000 nanospheres in H2O

2.2 大分子骨架对卟啉核的屏蔽效应

利用荧光探针法分别对THPPH2、SPPCL24、SPPCL24-PEO5000接受光照后的淬灭程度进行了研究，DPBF由于具有较强的荧光活性被用作试验的荧光探针［13－15］。卟啉类化合物能在特定波长激光照射下，受到激发而产生能量，能量传递给周围的氧，生成活性很强的单态氧。活性氧对荧光具有淬灭作用。因此，混合溶液系统在接受特定波长激光照射过程中，DPBF产生的荧光被卟啉产生的单态氧淬灭，导致DPBF荧光强度下降。如图7所示，相同光照时间内，加入含等量卟啉核的 THPPH2、SPPCL24、SPPCL24-PEO5000样品后的混合溶液系统的荧光强度均减弱了，但变化程度(ΔI)却有明显的差别，ΔITHPPH2＞ΔISPPCL24＞ΔISPPCL24-PEO5000。这证明了大分子骨架对卟啉核具有保护作用，使其在光照下缓慢持续地释放单态氧。这对于提高药物在肿瘤组织中的保留时间，达到持久疗效具有重要的临床意义，并且克服了小分子卟啉在体内易分散的缺点，从而降低对正常组织的毒性。

2.3 SPPCL-b-PEO共聚物自组装行为

图8是SPPCL-b-PEO共聚物胶束的TEM照片，可以明显观察到随着共聚物中亲水PEO链段质量分数的减小，共聚物自组装胶束的形态由球状逐渐转变为蠕虫状。SPPCL24-PEO5000(fPEO=69.2%)自组装形成了大小均一，尺寸大约50 nm的球状胶束;SPPCL24-PEO2000(fPEO=44.2%)形成了蠕虫状胶束，这种特殊的形态是由于共聚物中PEO的质量分数降低，胶束亲水表面中PEO链间斥力减少及表面张力增加，从而影响了系统亲-疏平衡而导致胶束形貌的改变。

图7 含THPPH2、SPPCL24和SPPCL24-PEO5000的混合样品溶液中DPBF的荧光激发光谱(1～3)及荧光强度在不同光照时间下的变化曲线(4)Fig 7 Fluorescence excitation spectra(1－3)and dynamic curve(4)of fluorescence intensities under different illumination timeof DPBF solutions in DMF respectively including THPPH2，SPPCL24，SPPCL24-PEO5000

图8 SPPCL-b-PEO共聚物的透射电镜照片Fig 8 TEM photographs of SPPCL-b-PEO copolymers

2.4 药物的负载与体外释放

多柔比星是一种广泛应用于临床的抗癌药物，在负载多柔比星的SPPCL24-PEO5000纳米微球的制备中，TEA用于中和盐酸多柔比星中的盐酸，使其变为疏水多柔比星，易与共聚物纳米微球的亲水表面相互作用，有利于负载。多柔比星的pKa=8.4，所以多柔比星在 pH 8.4的PBS溶液中可以得到13.8%的载药量和80.8%的包封率。

负载多柔比星的载药纳米微球的体外释放具有pH敏感应。这是因为多柔比星在碱性环境中是以疏水性游离分子态存在，而在酸性环境中则处于水溶性的离子态。图9为该载药微球在pH 7.4和pH 5.6的PBS体系中的累积释放曲线。可以看出，在释放的前10 h，两者都存在突释;10 h以后，释放曲线趋于平缓，药物在介质中缓慢释放。但是多柔比星在两种pH环境中的释放量有明显差别。在pH 7.4的介质中，12 h内释放了20.8%，96 h的累积释放量仅为39.9%。而在pH 5.6的介质中释放速率明显增大，12 h的释药量为43.2%，96 h已达到了73.4%。机体正常组织的pH值为7.4左右，而肿瘤组织的pH值为5～6。所以该纳米载药系统的释药特性有利于靶向于肿瘤细胞。

图9 37℃下负载多柔比星的SPPCL24-PEO5000纳米微球在pH7.4和5.6的PBS体系中的药物释放曲线Fig 9 Doxorubicin release curve of SPPCL24-PEO5000nanospheres in PBS solutions of pH7.4 and 5.6 at 37℃

3 讨论

本实验通过开环聚合和酯化反应，成功合成了一系列以卟啉为核的星型两亲性SPPCL-b-PEO共聚物。该共聚物不仅具有两亲性骨架，可在水中自组装形成胶束，还具有卟啉内核，具有良好的光敏性和肿瘤组织的靶向性，且大分子PCL-PEO骨架能有效阻止卟啉核的自淬灭。此外，以该共聚物作为载体的负载多柔比星的纳米微球，有较高的包封率和载药量。实验还发现载药纳米微球的释放具有pH敏感性，在酸性环境中能够快速大量释放药物，而在碱性环境中绝大多数药物仍然保留于载体中，有利于靶向肿瘤细胞。由于被载药物可选择性地在肿瘤细胞中释放，而对正常组织影响较小，负载多柔比星的SPPCL-b-PEO共聚物纳米微球符合抗肿瘤靶向给药系统的要求。

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