盐酸小檗碱对高糖、高脂联合诱导内皮细胞分泌TNF-α的干预作用

邵明柏 何秀婷 李 杰

(吉林大学第一医院老年干部科，吉林 长春 130021)

内皮细胞功能的紊乱是糖尿病血管并发症早期的重要特征〔1〕。有研究表明，炎症因子在糖尿病血管内皮损伤机制中发挥重要的作用〔2，3〕。近年研究表明，盐酸小檗碱(黄连素)能够降血糖、降血脂，改善胰岛素抵抗，对糖尿病具有很好的疗效〔4〕。本研究通过观察黄连素对高糖、高脂损伤的内皮细胞增殖率、一氧化氮(NO)、内皮素1(ET-1)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)分泌的影响，初步探讨其对高糖、高脂损伤的内皮细胞的保护作用及其可能机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器 黄连素购于中国药品检验所，氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL):北京欣源佳和生物科技有限公司，胎牛血清(FCS):美国，培养基DMEM、胰蛋白酶:美国Gibco公司，噻唑蓝(MTT):Sigma公司，二甲亚砜(DMSO):北京拜尔迪公司。NO、ET-l测定试剂盒:南京建成生物工程研究所，TNF-α ELISA试剂盒:北京博奥森。酶标仪、超低温冰箱、CO2培养箱:日本三洋公司，紫外可见分光光度计:上海精密科学仪器有限公司，高压灭菌锅:上海申安医疗器械厂，离心机:上海手术器械厂，倒置显微镜:日本OLYMPUS。

1.2 方法

1.2.1 人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的培养与鉴定 以0.1%胶原酶消化法分离内皮细胞，用完全M199〔含20%FCS，20 mg/L血管内皮细胞增长因子(ECGF)〕接种细胞于培养瓶(预先用0.4%明胶包被)，置37℃、5%CO2孵箱培养，当细胞融合成单层时，以0.125% 胰酶-0.02%乙二胺四乙酚(EDTA)消化传代，实验用第2～4代。用第Ⅷ因子相关抗原检测(SP免疫细胞化学染色法)阳性鉴定内皮细胞。

1.2.2 葡萄糖(Glu)+ox-LDL损伤HUVECs模型的建立 取对数生长期细胞，调整细胞数为5×104/ml，每孔200 ml接种于96孔培养板，每组设6个平行孔。将Glu 40 mmol/L+ox-LDL 100 mg/L培养细胞24～48 h，MTT检测，计算细胞存活率，建立Glu+ox-LDL损伤HUVECs模型。

1.2.3 MTT法检测黄连素对HUVECs增殖的影响 将细胞悬液按每孔1×105个细胞接种于96孔细胞培养板，在37℃、5%CO2的培养箱中培养数小时使细胞贴壁。培养细胞待细胞贴壁且状态良好，生长至 70% ～80%融合时，换含不同浓度Glu+ox-LDL培养基或含不同浓度Glu+ox-LDL+黄连素培养液，Glu+ox-LDL及黄连素储存液分别用培养基稀释至所需浓度。根据实验设计进行分组，每组设6个平行孔，每孔加培养液200μl，置于CO2培养箱中，37℃继续培养 24～48 h。每孔加入MTT溶液20μl，37℃继续孵育4 h，吸出上清液，每孔加入150μl DMSO，振荡10 min，使蓝色结晶物充分溶解。选择490 nm波长，在酶标仪上测定吸光值(OD)，取其平均值，计算细胞存活率。每项实验至少重复3次。细胞存活率=处理组细胞的OD平均值/对照组细胞的OD平均值×100%。

1.2.4 细胞培养上清中NO、ET-1和TNF-α的检测 将传代培养的细胞接种在96孔培养板中，分为五组:对照组:DMEM培养液 +10%胎牛血清;模型组:Glu 40 mmol/L+ox-LDL 100 mg/L;Glu+ox-LDL+黄连素1.25μg/ml;Glu+ox-LDL+黄连素2.5μg/ml;Glu+ox-LDL+黄连素5.0μg/ml，每组6个复孔。待细胞生长近70%融合时换为含有2%FCS的DMEM或含Glu+ox-LDL的培养基，同时加入各处理因素，孵育24 h，吸取细胞培养上清液，按照试剂盒说明进行NO、ET-1和TNF-α测定，根据公式计算出样本中所含NO、ET-1和TNF-α含量。

1.3 统计学方法 应用SPSS19.0软件进行单因素方差分析，数值变量资料采用表示。

2 结果

2.1 Glu+ox-LDL损伤HUVECs模型的建立 MTT法检测发现，Glu 40 mmol/L+ox-LDL 100 mg/L对HUVECs的损伤具有时间依赖性。Glu 40 mmol/L+ox-LDL 100 mg/L培养HUVECs 24 h，细胞存活率为(70.52±3.11)%(P＜0.05)，培养48 h细胞存活率降至(61.25±4.89)%(P＜0.05)。而不含Glu+ox-LDL的培养液对细胞无明显损伤，培养24 h细胞存活率为(97.24±1.66)%，培养48 h细胞存活率为(96.57±1.39)%。由此认为Glu 40 mmol/L+ox-LDL 100 mg/L培养24 h作为建立Glu+ox-LDL损伤HUVECs模型的条件。

2.2 黄连素对Glu+ox-LDL培养HUVECs存活率的影响 模型组〔(68.31±3.45)%〕培养 HUVECs 24 h，与对照组〔(98.12±1.99)%〕比较细胞存活率降低(P＜0.01)，同时应用 1.25、2.5、5.0μg/ml黄连素治疗，细胞存活率提高〔(14.19±2.06)、(76.35±2.67)、(79.69±2.34)%〕。但黄连素处理后各剂量组细胞存活率均未达到对照组水平。

2.3 黄连素对Glu+ox-LDL联合诱导损伤下HUVECs上清液中NO、ET-1含量的影响 与对照组比较，模型组HUVECs细胞NO释放量显著降低(P＜0.01);而黄连素各治疗组能不同程度地提高NO含量，其中黄连素5μg/ml提高NO分泌作用最强，与模型组比较 P＜0.01。模型组ET-1比对照组显著增高(P＜0.01)，说明造模成功;黄连素各治疗组比模型组明显降低(P＜0.01)。见表1。

2.4 黄连素对Glu、ox-LDL联合诱导损伤下内皮细胞培养液中TNF-α的影响 对照组与模型组内皮细胞培养液中TNF-α水平差别有统计学意义(P＜0.01)，说明造模成功;黄连素各治疗组比模型组内皮细胞培养液中TNF-α明显降低(P＜0.01)，但仍高于对照组(P＜0.01)。见表1。

表1 黄连素对Glu、ox-LDL联合损伤HUVECs上清液中NO 、ET-1、TNF-α含量的影响(n=6

表1 黄连素对Glu、ox-LDL联合损伤HUVECs上清液中NO 、ET-1、TNF-α含量的影响(n=6

与对照组比较:1)P＜0.01;与模型组比较:2)P＜0.01

?

3 讨论

糖尿病时异常血糖损害内皮细胞的形态和功能而导致糖尿病血管病变的发生〔5〕。本实验结果表明:Glu 40 mmol/L、ox-LDL 100 mg/L在培养48 h以上抑制HUVECs的增殖，且48 h较明显。黄连素浓度在5、2.5μg/ml可对抗高 Glu、ox-LDL抑制HUVECs的增殖作用，使细胞增殖率从损伤后的较低水平恢复到接近正常水平。

NO是内皮细胞产生的一种血管保护因子，由NO合酶(NOS)催化L-精氨酸产生。生理情况下，血管内皮中主要由eNOS催化产生NO。糖尿病伴血管损伤时，iNOs表达增加，高血糖可诱导iNOS表达，激活后的iNOS活性持续时间长，催化生成NO的量远远大于nNOS和eNOS催化产生NO的量。其结果使内皮细胞中NO合成增加〔6〕。本试验结果提示机制可能是:在损伤48 h内eNOS途径受损，而iNOS途径尚未激活，从而使NO含量明显降低。黄连素干预后，NO含量增加，提示黄连素可上调NO，并通过与相应受体结合，促进cGMP的合成，同时抑制细胞Ca2+内流，增高细胞膜K+通道的活性，而使血管平滑肌松弛、抗平滑肌增殖、抗血小板凝集以阻抑动脉粥样硬化而对2型糖尿病(T2DM)血管病变有益。

ET-1作为NO的拮抗剂，是由21个氨基酸构成的一种强烈而持久的血管收缩剂，主要由血管内皮细胞合成，它的稳定表达对维持血管的基础张力至关重要，其水平升高可使血管痉挛从而促使血栓形成并诱发动脉粥样硬化，对心脑血管疾病及糖尿病的血管并发症具有重要作用〔7，8〕。在T2DM血管内皮细胞受到物理和细胞因子的刺激，促使ET的合成和释放，使血浆ET水平增强。这种改变参与了动脉粥样硬化的发生、发展，并与动脉粥样硬化的程度与范围明显相关。本研究结果显示，在Glu、ox-LDL混合条件液下培养HUVECs 48 h后，ET-1含量增高，而使NO生物利用度下降，使细胞受到更严重的氧化损伤，且打破ET/NO的平衡，造成内皮细胞的舒缩障碍〔2〕，给予黄连素治疗后，ET-1含量降低，其可能机制是黄连素通过增加NO的含量，降低炎症因子的分泌，而降低ET-1的分泌。

TNF-α是两种重要的促炎性细胞因子，除诱导自身表达外还可诱导血小板衍生生长因子(PDGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、巨噬细胞集落刺激因子(MZCSF)、细胞黏附分子、原癌基因、凋亡相关基因等的表达，造成血管内皮细胞损伤，促进血管平滑肌细胞增殖，引起动脉粥样硬化而导致T2DM的血管并发症。本研究结果表明Glu、ox-LDL混合条件液下HUVECS培养液中TNF-α含量增加。给予黄连素治疗后TNF-α含量降低。其机制有待进一步研究。

综上，本实验证实了盐酸小檗碱具有保护内皮细胞作用，其作用机制可能与其调节内皮NO/ET-1平衡、抗炎作用有关。

1 Hadi HA，Suwaidi JA.Endothelial dysfunction in diabetes mellitus〔J〕.Vasc Health Risk Manage，2007;3(6):853-76.

2 Fornoni A，Iaz A，Tejada T，et al.Role of inflammation in diabetic nephropathy〔J〕.J Curr Diabetes Rev，2008;4(1):7-10.

3 沈寒蕾，谭晓丹，黄 媛，等.内脂素、TNF-α、IL-6在2型糖尿病患者大血管病变中的预测价值〔J〕.中国老年学杂志，2011;31(21):4110-1.

4 Zhang Y，Li X，Zou D，et al.Treatment of type 2 diabetes and dyslipidemia with the natural plant alkaloid berberine〔J〕.J Clin Endocrinol Metab，2008;93(7):2559-65.

5 张 卓，王春梅，王春艳.盐酸小檗碱对糖尿病大鼠胸主动脉内皮损伤的保护作用〔J〕.中国老年学杂志，2010;30(12):1654-7.

6 Spitaler MM，Graier WF.Vascular targets of redox signalling in diabetes mellitus〔J〕.Diabetologia，2002;45(4):476-94.

7 Sheu ML，Chiang CK，Tsai KS，et al.Inhibition of NADPH oxidase-related oxidative stress-triggered signaling by honokiol suppresses high glu-cose-induced human endothelial cell apoptosis〔J〕.Free Radic Biol Med，2008;44(12):2043-50.

8 Chen Y，MeCarron RM，Golech S，et al.ET-l-and NO-mediated signal transduction pathway in human brain capillary endothelial cells〔J〕.Am J Physiol Cell Physiol，2003;284(2):C243-9.