马齿苋多糖对老龄荷瘤小鼠抗宫颈癌的作用

赵 蕊 蔡亚平 陈志宝 邵兴月 贾桂燕

(八一农垦大学生命学院，黑龙江 大庆 163319)

马齿苋是我国古老的药食兼用植物。近年来研究表明，马齿苋具有调血脂、抗动脉硬化、抗肿瘤、抗衰老、降血糖等多种药理活性〔1〕。多糖作为一种重要的生命物质，具有多种生物活性，特别是抗肿瘤、免疫调节作用受到广泛关注〔2〕。本文以马齿苋为原料，研究马齿苋多糖(PHP)亚级分对老龄荷U14宫颈癌实体瘤和腹水瘤模型小鼠的抑瘤作用。

1 材料与方法

1.1 药品和试剂 PHP亚级分由本实验室制备并鉴定;环磷酰胺(CTX)购于山西普德制药厂;苏木精、伊红购于北京中山金桥生化试剂公司。试验中所用其他化学试剂均为分析纯。

1.2 试验动物和细胞株 昆明种小鼠(18～22)g，由协和医院动物研究所提供。小鼠宫颈癌U14细胞株引自中国医学科学院药物研究所，在小鼠腹腔中进行传代。

1.3 方法

1.3.1 PHP制备 马齿苋→脱单糖、低聚糖→脱色→水提取→浓缩→脱蛋白→多糖沉淀→干燥→马齿苋总多糖→离子交换层析→浓缩→脱盐→冷冻干燥→马齿苋多糖级分→凝胶柱层析→浓缩→冷冻干燥→PHP。

1.3.2 老龄小鼠模型制备 小鼠腹腔注射D-半乳糖(50 mg·kg－1·d－1)，连续 60 d。

1.3.3 小鼠急性毒性试验 预试验结果表明无法测出小鼠口服PHP的LD50，故改作1 d内最大耐受量试验。取小鼠20只，雌雄各半。试验前禁食(不禁水)12 h，进行小鼠急性经口毒理试验，每日采用最大浓度、最大体积、一次性灌胃给药，连续观察7 d，记录小鼠的行为、活动、摄食量、体重、粪便和死亡情况，未死亡的小鼠于1 w后处死进行尸检〔3〕。

1.3.4 急性毒性试验小鼠肝脏、肾脏病理切片观察 急性毒性试验小鼠连续用药7 d后，停药1 w后将存活小鼠断颈处死，无菌条件下迅速取出小鼠的肝脏和一侧肾脏，中性缓冲甲醛固定液进行固定，石蜡包埋，切片机切片，常规HE染色，光学显微镜下进行病理学观察。

1.3.5 急性毒性试验前、后小鼠血象的变化 急性毒性试验小鼠连续给药7 d后，停药1 w，摘眼球取血，抗凝后血细胞分析仪对小鼠红细胞数(RBC)、白细胞数(WBC)和血红蛋白(Hb)含量进行检测。

1.3.6 荷U14宫颈癌实体瘤、腹水瘤老龄小鼠模型的建立建模前小鼠禁食不禁水12 h。在无菌条件下，吸取在昆明种小鼠体内传代7～10 d的U14肿瘤细胞，生理盐水调整细胞密度为5×106/ml，于小鼠左前肢腋窝皮下及腹腔各接种0.2 ml，接种成功率100%。

1.3.7 试验动物分组和处理 肿瘤接种后24 h，实体瘤老龄小鼠模型动物随机分为4组，每组10只。而腹水瘤老龄小鼠模型动物随机分为8组，4组用于腹水瘤肿瘤抑制率的测定，每组10只;4组用于生命延长率的测定，每组10只。每一试验的4组分别为 PHP低剂量组〔PHP(L)，100 mg/kg〕、PHP高剂量组〔PHP(H)，200 mg/kg〕、阴性对照组(Control，生理盐水)和阳性对照组(CTX，25 mg/kg)。PHP(L)、PHP(H)处理组和Control组均采用灌胃给药，CTX对照组采用腹腔注射给药，给药剂量为人每千克体重临床用药量的12倍。所有动物每日给药1次，连续给药13 d。

1.3.8 肿瘤抑制率和生命延长率的测定 停药次日脱颈处死各组小鼠，取瘤块肉眼观察并进行称重，计算肿瘤抑制率;吸取腹腔中腹水，4%台盼蓝染色后，光学显微镜下计数肿瘤细胞数量;停药后让小鼠自然死亡，记录存活天数，计算各组小鼠生命延长率。

1.3.9 PHP对宫颈癌U14肺转移的干扰作用 无菌条件下，吸取在昆明种小鼠体内传代7～10 d的U14肿瘤细胞，生理盐水调整细胞密度为5×105/ml，吸取0.1 ml注射入小鼠尾静脉。分组方式如上所述，连续给药13 d后，次日断颈处死小鼠，迅速解剖出小鼠一侧肺组织，显微镜下观察肺组织并计数肺组织表面癌细胞转移克隆数〔4〕。

1.4 统计学处理 采用Origin7.5软件包，各组试验数据以表示，计量资料经方差齐性检验为方差齐性，两组间差异采用t检验，多组资料采用单因素方差分析。

2 结果

2.1 PHP用药安全性检测

2.1.1 急性毒性试验结果 对小鼠以PHP最大浓度最大体积进行灌胃给药，连续处理7 d，发现小鼠毛色光滑，活动、饮食、粪便色泽与质地均正常，1 w内无死亡及其他异常现象发生。处死后进行尸检，各主要脏器(心、肝、脾、肺、肾)经肉眼观察未见明显异常改变。

2.1.2 肝脏、肾脏病理切片观察 光镜下，急性毒性试验小鼠肝小叶结构完整，中央静脉居中，肝索向四周呈放射状分布，肝细胞排列整齐，胞核清晰，胞质丰富。急性毒性小鼠肾脏病理切片显示，肾小球、肾小管结构明显可见，肾细胞排列紧密，肾小球形状规则，肾小管结构清楚。表明PHP对小鼠肝脏、肾脏组织没有形成明显的毒性反应。见图1。

2.1.3 急性毒性试验前、后小鼠血常规的变化 急性毒性试验前、后，小鼠RBC、WBC及Hb含量均无显著变化(P＞0.05)，各指标均在正常范围之内，说明PHP对机体健康无明显损伤。见表1。

表1 急性毒性试验前、后小鼠血常规变化(，n=10)

表1 急性毒性试验前、后小鼠血常规变化(，n=10)

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2.2 PHP体内对老龄小鼠宫颈癌U14实体瘤和腹水瘤的生长抑制作用 PHP(L)和PHP(H)两组对小鼠移植性肿瘤均显示出明显的抑制作用，且小鼠精神状态良好，体重平稳增加，无死亡现象;Control组小鼠绝大部分精神状态不佳，摄食量显著减少，死亡3只，小鼠体重由于荷瘤也有所增加;而CTX组小鼠活跃，精神状态良好，但体重增加不明显。结果表明PHP对小鼠实体瘤具有抑制作用。为了进一步检测PHP体内的抗肿瘤效果，我们通过腹腔注射U14细胞建立了老龄小鼠荷腹水型U14宫颈癌模型。结果表明，各药物处理组小鼠腹水瘤肿瘤细胞数量均比Control组减少，提示PHP对腹水型老龄小鼠肿瘤的生长存在抑制作用。见表2，表3。

2.3 PHP对老龄荷瘤小鼠存活时间的影响 PHP(L)、PHP(H)和 CTX组小鼠的平均生存时间分别为(21.7±4.7)、(26.9±5.4)和(32.1±5.3)d，与 Control组〔(17.8±4.7)d〕相比，存活时间均显著延长(P＜0.01)，其存活时间延长率分别为21.93%、51.46%及80.73%。虽PHP(L)组小鼠存活时间较CTX组短(P＜0.05)，但PHP(H)却与之无显著差异(P＞0.05)，提示PHP对老龄荷瘤小鼠生存时间有延长作用。

2.4 PHP对老龄小鼠宫颈癌U14肺转移的干扰作用 宫颈癌U14细胞株为双向高转移细胞株，一般在接种后第7天开始转移，到第11天后可达80% ～100%肺和淋巴结转移。在宫颈癌肺转移试验中发现PHP对小鼠宫颈癌肺转移显示出抑制作用。转移结节数Control组为(137.4±20.1)个，PHP(L)、PHP(H)和 CTX组分别为(103.9±15.1)、(84.7±11.8)和(90.8±17.6)个，肺转移抑制率分别为 33.82%、24.57%、38.81%，提示PHP(L)、PHP(H)均对老龄小鼠宫颈癌U14的肺转移有抑制作用，作用效果与CTX类似。

表2 PHP处理对小鼠宫颈癌U14实体瘤的生长抑制作用

表2 PHP处理对小鼠宫颈癌U14实体瘤的生长抑制作用

与Control组比较:1)P＜0.05，2)P＜0.01;与CTX对照组比:3)P＜0.05

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表3 PHP处理对小鼠宫颈癌U14腹水瘤的生长抑制作用

表3 PHP处理对小鼠宫颈癌U14腹水瘤的生长抑制作用

与Control组比较:1)P＜0.01;与CTX组比较:2)P＜0.05

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3 讨论

本试验结果显示，PHP(L)、PHP(H)对老龄小鼠宫颈癌的生长均有显著抑制作用，另外，PHP(L)和PHP(H)均能够显著延长老龄荷瘤小鼠的存活时间。宫颈癌发生侵袭与转移是导致患者死亡的主要原因，淋巴转移是宫颈癌主要的不良预后因素之一〔5〕。因此，控制侵袭和转移成为宫颈癌患者预后的关键因素，研发具有抗宫颈癌转移的低毒新药有着十分重要的意义。本研究结果表明，CTX对局部生长的肿瘤和循环性肿瘤的胞毒作用效果存在一定差异。CTX在以体重减轻为代价的基础上可使实体肿瘤生长和腹水型肿瘤生长受到抑制，但对循环转移的肿瘤细胞这种破坏作用效果较弱。本研究结果支持局部生长的肿瘤和转移的肿瘤具有不同的化学敏感性这一观点〔6〕。在特定区域快速增殖的肿瘤细胞是抗癌药物如CTX的作用靶点，而在血液和淋巴中循环的转移细胞受DNA-靶性抗癌药物的影响则较小。本研究结果却表明，PHP在老龄小鼠体内表现出显著抑制肿瘤生长作用的同时，对小鼠宫颈癌U14的肺转移也存在显著的抑制作用，其机制可能是由于PHP激活的免疫细胞在血液和淋巴器官中与循环的肿瘤细胞相遇，进而对肿瘤细胞进行破坏所造成的，因此，PHP也大大降低了老龄小鼠宫颈癌术后复发转移的风险。宫颈癌局部的侵袭与远处转移是肿瘤细胞与宿主细胞、细胞外基质之间一系列复杂、多步骤、多因素相互作用的动态过程，具体机制有待于进一步研究。

1 向 兰，邢东明，王 伟，等.马齿苋的化学成分研究进展〔J〕.亚太传统医药，2006;9(7):64-8.

2 崔 吴，尹 苗，安利国.马齿苋多糖的抗肿瘤活性〔J〕.山东师范大学学报(自然科学版)，2002;17(1):72-6.

3 陈 奇.中药药理研究方法学〔M〕.北京:人民卫生出版社，1994:1085-6.

4 Zou D，Shibuya M，Shinoda K，et al.The difference of angiogenesis in human lung adenocarcinoma cell lines with different metastatic potency〔J〕.J Nippon Med Sch，2004;71(3):181-9.

5 Kato R，Ishikawa T，Kamiya S，et al.A new type of antimetastatic peptide derived from fibronectin〔J〕.Clin Cancer Res，2002;8(3):2455-62.

6 Furukawa T，Kubota T，Watanabe M，et al.Immunochemotherapy prevents human colon cancer metastasis after orthotopic on plantation of histologically intact tumor tissue in nude mice〔J〕.Anticancer Res，1993;13(7):287-91.