康脑液对脑缺血大鼠Fas、Caspase-3蛋白表达的影响

马 倩 耿 倩 薛 茜 邹玉安

(河北北方学院，河北 张家口 075000)

缺血性脑血管病(ICVD)患者总人数可达500万～600万，存活者有约75%的高致残率〔1〕。目前认为凋亡是迟发性脑死亡的主要形式，凋亡在脑缺血再灌注损伤发病机制中发挥着重要作用。本实验通过观察康脑液对脑缺血再灌注(I/R)大鼠的保护作用，从细胞凋亡因子Fas、Caspase-3蛋白表达的角度研究其作用机制，为临床用药提供依据。

1 材料与方法

1.1 药品及试剂 康脑液:由黄芪、丹参、川芎、葛根、钩藤、三七粉等组成，药材购于河北北方学院附属第一医院，冷水浸泡30 min，文火煎煮3次，每次15 min，滤出药渣，将2次煎取的药液混匀，文火分别浓缩成400%、200%、100%康脑液(每毫升含生药4 g、2 g、1 g)，最后4℃冰箱保存备用。依达拉奉注射液，规格:20 ml/30 mg，批号:061218，南京先声东元制药有限公司提供，4%多聚甲醛，购自美国 Sigma公司。兔抗大鼠 Fas、Caspase-3一抗体及相应二抗(江苏镇江生物技术有限公司)。

1.2 实验仪器 自动脱水机(美国Thermo)，电脑生物组织包埋机(浙江金华科迪)，石蜡切片机(美国Thermo)，电脑生物组织摊烤片机(浙江金华科迪)，光学显微镜(日本OLYMPUSBX60型)，显微摄影装置(日本NIKON)。

1.3 实验动物分组及给药 SPF级雄性SD大鼠126只，体重200～280 g，购自北京大学医学部动物中心〔许可证号SCXK(京)2006-0008〕。随机分为:假手术组、模型组、依达拉奉组(2.7 mg/kg)、康脑液高(24.0 g·kg－1·d－1)、中(12.0 g·kg－1·d－1)、低(6.0 g·kg－1·d－1)剂量组，假手术组 6 只，其余各组每组24只，术前7 d开始灌胃给药，最后一次给药后60 min实施脑I/R手术，每天早晨给药1次，术后继续给药，直至处死。给药剂量按大鼠与人体表面积等效剂量折算，假手术组及模型组灌等体积蒸馏水。采用改良Longa线栓法，制备大鼠右侧大脑中动脉阻塞(MCAO)模型。

1.4 Fas、Caspase-3蛋白检测 各组大鼠分别于再灌注时间点后取脑，7%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，首先用0.9%生理盐水150 ml心脏灌注，直至冲出的液体变清亮后立即换用4%多聚甲醛心脏灌注固定，大鼠全身僵硬后快速断头取脑，从前向后将脑组织分为5等分，切成2～3 mm的脑片，4%多聚甲醛固定液中继续固定24 h。常规梯度乙醇脱水，二甲苯透明，浸蜡，包埋。切片3μm，采用免疫组织化学(S-P二步法，按说明操作)检测Fas、Caspase-3蛋白表达。

1.5 统计学处理 采用SPSS17.0进行处理，每组数据以表示。各指标组间比较采用t检验。

2 结果

2.1 大鼠脑组织Fas蛋白表达结果 光镜下(×400)在梗死周边区随机选取5个互不重叠视野，计数阳性细胞数。免疫组化染色显示，Fas主要分布在细胞质，着色为棕黄色。与假手术组比较，模型组Fas蛋白表达水平均显著上调(P＜0.01)。与模型组比较，康脑液各组、依达拉奉组Fas蛋白表达明显下降(P ＜0.01，P ＜0.05)。见表1，图1。

2.2 大鼠脑组织Caspase-3蛋白表达结果 光镜下(×400)在梗死周边区随机选取5个互不重叠视野，计数阳性细胞数。免疫组化染色显示，Caspase-3主要分布在细胞质，着色为棕黄色。与假手术组比较，模型组Caspase-3蛋白表达水平均显著上调(P＜0.01)。与模型组比较，康脑液各组、依达拉奉组Caspase-3蛋白表达明显下降(P＜0.01，P＜0.05)。见表2，图2。

表1 各大鼠Fas的表达结果(n=6

与假手术组比较:1)P＜0.01;与模型组比较:2)P＜0.05，3)P＜0.01，下表同

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表2 各组大鼠Caspase-3的表达结果(n=6

表2 各组大鼠Caspase-3的表达结果(n=6

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3 讨论

I/R损伤涉及许多复杂的级联反应，包括许多环节，如兴奋性氨基酸的毒性作用，细胞内Ca2+超载、线粒体功能障碍、炎性介质的释放，凋亡基因的表达等〔2〕。这些因素紧密联系，互为因果、最终导致神经细胞凋亡或坏死。细胞凋亡是神经元细胞的主要死亡方式，其中促凋亡因子Fas、Caspase-3的表达与凋亡关系密切。Fas参与了脑缺血再灌注的病理生理过程〔3〕。Caspase-3的活化在细胞凋亡过程中起着关键作用，因此抑制Caspase-3蛋白表达可阻断细胞凋亡的瀑布反应。本研究结果显示，假手术组各时间点大鼠Fas和Caspase-3阳性细胞数表达不明显。在坏死边缘区，模型组各时间点Fas和Caspase-3细胞数不同程度增加。康脑液各组能减少梗死灶周边细胞Fas和Caspase-3表达，因此可以促进神经元的恢复。

从中医角度来讲脑血管病的主要病机为“气虚血瘀”，治疗原则应以“益气活血化瘀”为主。康脑液为临床经验方，由补阳还五汤化裁而来，由黄芪、丹参、钩藤、三七粉等组成，具有益气活血化瘀、清热平肝、熄风定惊的作用。研究证实益气活血法〔4，5〕对缺血性脑血管病能够起到治疗作用。张运克等〔6〕证实补阳还五汤能够抑制细胞凋亡，从而保护脑组织。各单药黄芪〔7〕，钩藤〔8〕，三七〔9〕等有不同的治疗脑梗死的作用，因此研究康脑液的作用机制给脑血管病患者带来了希望。

综上，康脑液通过抑制早期Fas蛋白的表达，进而阻断Caspase-3引起的凋亡瀑布反应，从而保护脑组织。

1 Jia Q，Liu LP，Wang YL.Stroke in China〔J〕.Clin Exp Pharmacol Physiol，2010;37(2):259-64.

2 李 涵，陈 萌.脑缺血再灌注损伤后神经元损伤机制的研究进展〔J〕.承德医学院学报，2007;24(4):413-5.

3 吴 刚，薛荣亮，吕建瑞，等.全脑缺血再灌注后Fas、TNFR1蛋白的表达与细胞凋亡的关系及Bcl-2过度表达对其的影响〔J〕.南方医科大学学报，2011;31(8):1298-303.

4 李 净，王 键，胡建鹏，等.益气活血法对气虚血瘀脑缺血再灌注损伤大鼠一氧化氮含量和神经细胞凋亡的影响〔J〕.中国中医基础医学杂志，2007;13(12):898-900.

5 刘学源.益气活血法治疗急性缺血性脑血管病的实验研究〔J〕.中国中医药现代远程教育，2010;8(15):9-11.

6 张运克.补阳还五汤及拆方对脑缺血再灌注SD大鼠模型细胞凋亡及Bcl-2、Bax蛋白表达的影响〔J〕.中华中医药杂志，2007;22(6):404-7.

7 任 非，龚淑英，智丽敏，等.黄芪治疗缺血性脑损伤的有效性〔J〕.中国临床康复，2006;10(3):149-51.

8 唐映红，张淑萍，梁 燕，等.三七总皂苷对大鼠脑缺血再灌注后白细胞介素21β和其相关因子及半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶表达的影响〔J〕.中西医结合学报，2007;5(3):328-32.

9 高丽娜，宋 宇，徐 薇，等.钩藤碱对缺血再灌注诱导大鼠星形胶质细胞损伤的作用〔J〕.药学与临床研究，2009;17(1):1-4.