旋覆花素对阿尔茨海默病模型大鼠脑海马组织Bax，Bcl-2表达的影响

王英杰 柴锡庆 黄冬霞 李文胜 安小蕾 王书秀 王文胜

(河北医科大学基础医学研究所 省部共建教育部重点实验室，河北 石家庄 050017)

生理情况下，细胞凋亡参与调节体内正常细胞的更新和异常细胞的清除，对于确保细胞增殖与更新之间的平衡、维持细胞数量的稳定起着重要作用〔1〕。神经细胞凋亡是阿尔茨海默病(AD)等退行性疾病发展过程中的重要事件〔2～4〕，凋亡的神经细胞是不可逆的，但处于凋亡过程中的神经细胞存在不同程度的可逆性。本实验观察旋覆花素对Aβ海马内注射诱导的AD模型大鼠脑海马组织凋亡相关基因变化的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康雄性SD大鼠30只(河北省实验动物中心提供，动物合格证号:611071)，鼠龄 10～12月龄，体重(364.5±15.0)g，随机分为对照组、模型组和旋覆花素给药组，每组10只。给药组术前 3 d及术后每天用旋覆花素26 mg·kg－1·d－1灌胃，共21 d。模型组用旋覆花素的溶剂吐温80水溶液同法处理。

1.2 试剂与仪器 旋覆花素由河北医科大学药学院从欧亚旋覆花的氯仿提取物中分离制备，含ABL 2.66 g/L。Aβ25～35购自Sigma公司;Bax、Bcl-2抗体购自Santa Cruz公司;免疫组化试剂盒购自北京中杉金桥生物技术公司;脑立体定向仪:江湾Ⅰ型C，上海川沙花木农机厂制造。

1.3 Aβ25～35的孵育 用无菌生理盐水将 Aβ25～35稀释成10 g/L，37 ℃孵育72 h，使其变为聚集状态的 Aβ25～35，置于在4℃冰箱备用。

1.4 药物海马内注射方法 大鼠用质量浓度为20 g/L乌拉坦60 mg/kg腹腔注射麻醉后，固定于脑立体定向仪上。参照大鼠脑立体定位图谱〔2〕，以前囟为零点，于前囟后 3.5 mm，中线右侧旁开2 mm，为穿刺点，用牙科钻钻开颅骨，以微量注射器自脑表面垂直进针3 mm，分别于双侧海马CA1区于5 min内缓慢注射 Aβ25～35各 1 μl(10 μg)，5 min缓慢注入，留针5 min，对照组注射等量的生理盐水，退针缝合伤口。术前3 d及术后18 d，给药组给旋覆花素 26 mg·kg－1·d－1分两次灌胃，模型组给予等量溶剂。

1.5 免疫组织化学染色 参照使用说明书进行经过乙醇梯度脱水、石蜡垂直包埋，间断均匀切片，切片厚约 10μm，采用SABC方法进行免疫组化染色。分别以抗Bax(1∶200)、抗 Bcl-2(1∶200)抗体为一抗，其他操作按试剂盒说明书进行。以镜下出现棕黄色颗粒作为判定阳性染色的标准。用PBS替代一抗作为阴性对照。

1.6 Western印迹分析 各组取等量蛋白提取液，Bax为80μg，Bcl-2约为80μg，经 12%SDS-PAGE电泳分离后，于半干转膜仪上转移至PVDF膜，用5%的脱脂奶粉封闭，分别与抗Bax抗体(1∶200)、抗 Bcl-2抗体(1∶200)在 4℃条件下反应过夜。然后与HRP标记的相应二抗(1∶10 000)室温反应2 h，室温条件下用TTBS、TBS充分震荡洗膜后采用化学发光法显影。用美国Kodak公司ID数码成像分析系统分析结果。采用美国Kodark公司数码成像分析软件对Western印显色区带的信号强度进行相对定量分析。

1.7 统计学分析 数据采用SPSS13.0软件，计量资料以表示，组间资料应用单因素方差分析。

2 结果

2.1 旋覆花素对AD模型大鼠脑海马组织Bax基因表达的影响 模型组大鼠脑海马组织中Bax表达显著增强，染色细胞数量多，着色深。应用旋覆花素治疗后，染色细胞数量减少，着色变浅(图1)。模型组大鼠脑海马组织 Bax表达明显较对照组高，给予旋覆花素治疗后，给药组大鼠脑海马组织 Bax表达下降(P＜0.05)。见图2。

2.2 旋覆花素对AD模型大鼠脑海马组织Bcl-2基因表达的影响 免疫组化染色发现，与对照组海马组织相比，模型组和旋覆花素给药组大鼠脑海马组织的染色无明显加深，染色细胞数量无明显增多。Western印迹显示，对照组大鼠脑海马组织Bcl-2表达量与模型组及旋覆花素给药组大鼠脑海马组织表达量无明显差别(P＞0.05)，提示旋覆花素对Aβ诱导的AD模型大鼠脑海马组织的Bcl-2基因的表达影响不大。

3 讨论

Bcl-2属凋亡抑制基因而Bax为凋亡促进基因。NO及其代谢产物NO2、羟基自由基等可导致脂质过氧化、蛋白质氧化和DNA损害。NO诱导的神经毒性表现在Bcl-2减少、Bax增多以及caspase活化〔5〕。Nie等〔6〕研究发现人参环氧炔醇和人参醇可以抑制NO增高引起的脑皮质神经元的凋亡，其机制可能为促进Bcl-2表达、抑制Bax表达。抗精神失常药喹硫平可改善APP/PS1双转基因鼠的神经损害，抑制β分泌酶(BACE1)表达及活性，减少Aβ沉积，同时Bcl-2表达增加，推测上述改变与Bcl-2的作用有关〔7〕。而体外实验也证实Aβ42可通过升高Bax/Bcl-2比率引起人神经母细胞瘤细胞死亡〔8〕。Bcl-2和Bax在AD中有着关键作用〔9〕。本实验提示旋覆花素主要通过抑制促凋亡基因Bax的表达，发挥其抑制Aβ海马内注射诱导AD模型大鼠神经细胞的凋亡。旋覆花素主要通过抑制促凋亡基因Bax的表达，从而抑制Aβ诱导的AD模型大鼠脑海马的神经细胞凋亡，发挥神经细胞的保护作用，而对凋亡抑制基因Bcl-2表达影响不大。

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