PCR－膜芯片检测痰结核杆菌耐药基因突变的应用研究

谭景尹，胡水秀，韦世录，李翠萍，何 晓，何 敏＊，黄惠妮，郑艳燕，周昌明

（1.南宁市卫生监督所，广西 南宁530011；2.广西龙潭医院，广西 柳州545005；3.广西医科大学医学科学实验中心，广西 南宁530021；4.广西医科大学公共卫生学院，广西 南宁530021；5.广西疾病预防控制中心，广西 南宁530021）

随着联合药物的使用，结核分支杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）耐药菌株的出现和传播成为全球结核病疫情急剧恶化的主要原因。2006年在116个国家和地区250多万的病人诊断为活动性肺结核，有12万是耐药结核病（Drug－resistant tuberculosis，DR－TB）［1］，已成为我国严重的公共卫生和社会问题。由于大量的临床诊断病例因缺乏实验室阳性结果而无法进一步的耐药性检测，结核病实验室诊断和耐药性检测技术研究一直是国内外共同关注的焦点［2］。痰涂片、MTB培养加药敏试验仍是目前临床广泛采用鉴定MTB及其耐药性的“金标准”，但对结核杆菌尤其是耐药菌株的检出率低，需时长，无法满足临床诊断与指导用药的需要［3］。寻找简便、灵敏、特异的方法，提高结核病临床诊断的实验室检出率，并准确地检测结核杆菌耐药性，对耐药结核病的早期诊断、有效化疗和控制传播极其重要。本课题组在前期研究中，以临床分离株为对象利用反向点膜杂交（reverse dot blot hybridization，RDB）法构建了检测耐药结核杆菌的膜芯片及反应体系［4］并对其进行优化，明显提高了结核杆菌的检出率，将该技术直接应用于结核患者的痰样本，一次性对六种一线抗结核药物的耐药基因突变进行检测极大地缩短了检测所需的时间。

1 材料与方法

1.1 标本来源 根据我国目前肺结核的诊断标准［5］，由广西龙潭医院提供的82例痰标本中，诊断为结核病的患者64例，痰涂片阳性14例，阴性50例；非结核病（其他呼吸系统疾病）18例。

1.2 主要试剂 蛋白酶K、Premix taq（美国Takala公司），结核杆菌IS6110基因的特异性引物和检测探针（南宁中加免疫公司），多重PCR引物及寡核苷酸探针（上海生工公司合成并纯化），尼龙膜（美国Pall公司），A液（2×SSC，0.1%SDS，pH7.4），B液（0.5×SSC，0.1%SDS，pH7.4），C液（0.1mol／L柠檬酸钠，pH5.4），POD母液和TMB（深圳亚能生物公司）。

1.3 标本的处理 64例结核患者的痰标本均分为两份，一份由龙潭医院进行痰培养及药敏试验；另一份加入两倍体积的4%NaOH溶液，行液化处理后，高温高压灭菌。吸打混匀，分装至1.5ml的离心管，每管1ml。加入200μl消化缓冲液和20μl 20 mg／mL蛋白酶K，摇匀后56℃水浴3h，追加30μl蛋白酶K；消化过夜至痰液澄清透明。沸水浴10 min以灭活蛋白酶K。加入等体积的酚：氯仿：已戊醇混和液提取DNA。

1.4 TB膜芯片检测结核杆菌IS6110基因 参照文献［6］，膜芯片上结合3个专利检测探针（专利200510019561.7）。

1.5 耐药－TB膜芯片检测结核杆菌耐药基因突变12对特异性引物（专利200910114023.4）由上海生工合成并纯化；以TB膜芯片检测阳性的痰标本中结核杆菌DNA为模板进行多重PCR扩增，引物浓度10μM，模板DNA 5μl，总体积50μl分4管进行多重PCR扩增；反应程序为95℃预变性5min，94℃变性50s，60℃退火45s，72℃延伸50s，38个循环，最后72℃延伸5min。59个寡核苷酸探针（专利200910114023.4）由上海生工合成并纯化；将点有探针的尼龙膜放入50ml离心管中，加入A液8－10ml，50℃预热15min。同时PCR产物98℃变性10min，立即置于冰上5min。将已变性为单链的PCR产物加入带有膜片的离心管中，置50℃杂交炉中杂交6h。同时另加40ml B液于新的离心管中50℃杂交炉预热1h以上。将膜片移入已预热的B液中洗5min，50℃轻摇。取POD母液5μl用A液按1∶2000稀释，将膜片放入轻摇，孵育45 min。A液室温洗膜5min，重复一次。C液室温洗膜2min。新鲜配制显色液，按19ml C液＋1ml TMB＋10μl 3%H2O2的顺序加入。膜片放入显色液避光显色15min。以出现明显蓝紫色斑点为阳性结果。

1.6 DNA测序验证 将结核杆菌耐药基因PCR扩增阳性的标本送上海生工公司进行产物测序，测序结果与耐药－TB膜芯片检测的结果进行比较验证。

1.7 统计分析 TB膜芯片与痰涂片检测结核杆菌阳性率的结果比较采用SPSS13.0统计软件进行卡方检验，以P＜0.01为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TB膜芯片与痰涂片结果比较 18例非结核患者的痰涂片检测与TB膜芯片检测特异度均为100%（18／18）；64例结核患者（包括确诊及临床诊断病例）痰涂片检测的阳性率为21.9%（14／64），TB膜芯片检测的阳性率为81.3% （52／64）。两种方法检测结核杆菌的阳性率差异有统计学意义（χ2＝36.03，P＜0.01），TB膜芯片检测结核杆菌的阳性率明显高于痰涂片检查。此外，在痰涂片阴性的临床诊断病例中，TB膜芯片对结核杆菌的检出率为76.0%（38／50）（见表1）。82例痰标本中，痰涂片检测的阳性预测值为100%（14／14），阴性预测值为26.5%（18／68）；TB膜芯片检测的阳性预测值为100%（52／52），阴性预测值为60%（18／30）。TB膜芯片检测结核杆菌可减少假阴性结果。

表1 TB膜芯片与痰涂片检测痰标本中结核杆菌的结果

2.2 耐药－TB膜芯片检测结核杆菌耐药基因突变的结果 耐药－TB膜芯片检测52例痰标本（TB膜芯片检测阳性）中的结核杆菌耐药基因，5例检出耐药基因突变，其中单INH基因突变的1例，单RFP基因突变的1例，INH和RFP基因同时突变的2例，INH、RFP和SM基因同时突变的1例。

2.3 耐药－TB膜芯片与药敏及DNA测序结果比较

64例结核患者的痰标本中，20例痰培养阳性的标本药敏试验检出5例耐药；将这5例标本的药敏结果与耐药－TB膜芯片的检测及DNA测序结果进行比较发现：4例耐药－TB膜芯片检测结果与药敏试验及DNA测序结果基本符合（见表2），但由于膜芯片没有设置相应gy95位点检测探针，因此无法检出相应gy95位点突变。此外，痰培养阴性的标本中耐药－TB膜芯片检测出1例存在INH的ka315位点突变，与DNA测序结果完全一致（见表2）。

表2 药敏试验结果与PCR－膜芯片及DNA测序结果的比较

3 讨论

目前结核病患者感染原发性耐药株的比例较高，并呈上升趋势，对结核症患者进行结核杆菌及其耐药性的检测是非常必要［7］。PCR－反向斑点杂交法应用DNA探针、核酸杂交、酶联显色3方面技术，同时检测结核杆菌多个药物的耐药性［8］，是国内外研究的热点。Morcillo等［9］应用该法检测rpoB基因突变的灵敏度和特异度分别达到92.8%和100%；吴雪琼等用该法同时检测结核杆菌4种以上耐药基因突变，与测序验证完全相符［10］。由于上述研究均以单纯结核杆菌培养菌株为标本，从中提取的DNA产量及纯度相对较高，因此检测结果显示出较高的敏感性和特异性。但上述结果受临床分离株的培养时间长，阳性率低的限制，因此，近几年有学者以单一或3－5种抗结核药物的耐药基因为靶基因，直接利用该技术检测痰标本耐药基因的突变，得到部分结果与药敏试验及测序结果相符［11－13］。

本研究一次性检测六种一线抗结核药物耐药基因突变，分两大步骤实施。首先利用本课题组专利的TB膜芯片技术，通过结核杆菌IS6110基因确认痰标本中结核杆菌阳性，在特异度相同情况下，TB膜芯片法检测结核杆菌的阳性率（81.3%）显著高于痰涂片法（21.9%）（P＜0.01），特别在痰涂片阴性的结核患者中，TB膜芯片对结核杆菌的检出率高达76.0%；而在阳性预测值相同的情况下，TB膜芯片法检测结核杆菌的阴性预测值（60%）明显高于痰涂片法（26.5%）。说明TB膜芯片法在直接检测临床标本中的结核杆菌方面具有较高的特异性和敏感性，可以为结核病的初筛及临床诊断提供更方便快捷的检测手段。第二步通过耐药－TB膜芯片对52例结核杆菌阳性的痰标本，一次性进行异烟肼、利福平、链霉素、乙胺丁醇、比嗪酰胺、氟喹诺酮6种一线抗结核药物的katG、inhA、oxyR－ahpC、rpoB、rpsL、rrs、embB、pncA、gyrA 9个耐药基因的检测，结果检出5例耐药基因突变，其中4例与药敏和测序结果一致，由于膜片中探针的限制，部分突变类型分散在本检测膜片覆盖的序列之外，也有可能存在其他耐药机制［14］，使得耐药－TB膜芯片检测的结果没有完全与药敏和测序结果一致。针对检测受膜片设置探针限制这一缺点，可以根据研究的进展和实际需要随时增添有关探针确保最大的检出率［15］。此外，还有1例痰标本结核杆菌培养阴性，耐药－TB膜芯片检测与测序验证结果均检测出耐药突变位点且完全相符，提示该病人可能存在异烟肼耐药。

综上所述，PCR－膜芯片技术具有简便快捷、经济安全、较高的特异性和敏感性等优点，并可以直接检测出痰标本中未经培养的结核分支杆菌耐药基因突变，48小时内即可提供检测结果，从而弥补常规药敏试验的不足，为结核病临床耐药性的判定提供参考依据。但由于临床标本的处理和靶DNA浓度对PCR扩增有直接影响［16］，因此标本DNA的提取方法还有待于继续改进完善；同时由于检测过程受到各种实验因素和环境的影响，该法的稳定性和重复性也有待提高。

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