水库水中叶绿素a测定方法比较

2013-05-29冷维亮毕钦祥刘英昊朱琳琳

治淮 2013年12期

冷维亮毕钦祥刘英昊史振朱琳琳

（山东省潍坊市水文局潍坊 261031）

1 引言

在水库富营养化的研究中，叶绿素a是表征浮游植物生物量的最常用指标之一。叶绿素a的实验室测量方法有分光光度法、荧光法、色谱法，其中传统的分光光度法因所需仪器价格较低、操作简单、测定结果稳定，因此应用最为广泛。2013年之前采用的标准方法存在耗时长、提取不完全、步骤繁琐等缺点，根据一些文献报道提出的对标准方法的优化和改进，水利部发布了新的测定标准以代替原先采用的测定标准。新标准与老标准的不同之处主要包括以下四个方面：（1）改变了滤膜类型，用玻璃纤维滤膜代替了原标准中的醋酸纤维滤膜；（2）改变了水样过滤时的操作，由原标准的抽干滤膜改为不抽干滤膜，而是在减压状态下缓慢结束抽滤，最后用滤纸吸干水分；（3）改变了细胞破碎方式，用反复冻融法代替了之前的研磨法；（4）改变了提取时间，由原标准的24h改为4～12h。新标准已经发布近一年时间，目前尚无对新老标准的系统性比较评价。

本文选取以上新老标准中的4点不同，以潍坊峡山水库的库中水样为实验对象，进行叶绿素a的测定比较。从叶绿素a细胞破碎的程度、提取的完全性、数据的稳定性和操作的简便性等方面对两种测定方法进行比较，为水库的富营养化浮游植物的生物量的快速、稳定且准确的表征标准的选择提供资料。

2 实验材料与方法

2.1 材料

峡山水库库中水20L，采集于深色塑料桶中，每升水样加入1mL1%的碳酸镁悬浊液，以防止酸化引起的色素溶解。

化学试剂：90%丙酮溶液、1%碳酸镁悬浊液。

其他材料：醋酸纤维滤膜（0.45μm）、玻璃纤维滤膜（0.7μm）、研钵、布氏漏斗、抽滤瓶、具塞刻度离心管(10mL)、移液管等。

2.2 主要仪器与设备

真空泵、离心机、超低温冰箱、UV-分光光度计等。

2.3 实验方法

实验由两名分析人员同时进行。根据需要比较的内容，分别根据新老标准进行以下4个步骤。由于比较的侧重点放在新标准上，所以除比较的步骤外，其他均按照新标准进行操作，A组严格按照新标准进行操作，作为参照组与其他组进行比较。根据峡山水库库中水叶绿素a常规含量，均取1000mL水样进行测定，比色皿光程选用3cm。

2.3.1叶绿素a的抽滤

2.3.1.1滤膜的选择

A组选取玻璃纤维滤膜（0.7μm），B组选取醋酸纤维滤膜（0.45μm）进行抽滤。均在水样刚刚完全通过滤膜时结束抽滤，用镊子小心将滤膜取出，将有样品的一面对折，用滤纸吸干剩余水分。

2.3.1.2抽滤的操作

均选取玻璃纤维滤膜（0.7μm）进行抽滤，A组逐渐减压，在水样刚刚完全通过滤膜时结束抽滤。用镊子小心将滤膜取出，将有样品的一面对折，用滤纸吸干剩余水分。C组抽滤至过滤器内无水分后，继续抽滤几分钟。

2.3.2叶绿素a的提取

2.3.2.1细胞的破碎

均选取玻璃纤维滤膜（0.7μm）进行抽滤，且按照以上2.3.1.2中A组的方法处理滤膜。A组将过滤后的滤膜放入具塞玻璃离心管中，盖紧塞帽，放入-40℃低温冰箱中冷冻20min，取出放置于室温下5min，此过程反复3次。向离心管中加入10mL90%丙酮溶液，盖紧塞帽剧烈摇振片刻。D组将载有浓缩样品的滤膜放入研钵中，加入3mL丙酮溶液至滤纸浸湿的程度，把滤膜研碎，再少量地加90%的丙酮溶液，把滤膜完全研碎，然后用90%丙酮溶液将已磨碎的滤膜和丙酮溶液洗入带刻度的带塞离心管中。

2.3.2.2叶绿素a的提取

均使用反复冻融法对细胞进行破碎，A组放置于4℃冰箱中避光浸泡12h备用，在浸泡过程中再次摇振2～3次。E组置于4℃的冰箱中避光浸泡24h。

3 实验结果与比较

3.1 实验结果

对以上5组提取液测定吸光度，求算叶绿素a含量。检测结果见表1，其中1、2为两位分析人员的编号。

实验结果表明，从对叶绿素a提取的效率即叶绿素a提取含量的均值看，滤膜类型的选择和提取时间12h/24h对检测结果基本没有影响，抽滤方式和细胞破碎方式的不同对检测结果的影响较为明显。以下将结合实验过程进行详细分析。

3.2 滤膜选择的影响

虽然对最终检测的结果影响较小，但在实验过程中发现，选取醋酸纤维滤膜（0.45μm）的B组在测定吸光度时，750nm处的吸光度在0.007～0.010之间，不能满足标准不超过0.005的要求。经过取上清液再次离心、标定，此过程反复2次，经第3次离心之后吸光度才满足标准要求。造成这种情况的原因在于醋酸纤维滤膜能够部分溶解于丙酮溶液中，对750nm处的吸光度造成一定的影响，而玻璃纤维滤膜是不溶于丙酮溶液的。所以，在条件允许的情况下，尽量选取玻璃纤维滤膜，否则应多次离心或者离心后采用针式过滤器过滤，保证750nm吸光度不超过0.005。

表1 检测结果比较

3.3 抽滤选择的影响

从实验结果看，抽干的滤膜检测结果要比用滤纸吸干偏小。造成这种情况的原因在于采用反复冻融法对细胞进行破碎，是利用细胞内冰粒的形成和细胞液浓度的增高引起溶胀来达到破碎细胞壁的目的，因此抽滤后的滤膜不宜过干。所以在冻融的过程中，由于滤膜水分含量较少，冰冻和溶解时间不宜过长，冰冻时间应控制在20～30min，溶解时间为5min左右，滤膜变软即可。

3.4 细胞破碎方式的影响

大量文献表明，研磨法容易造成检测结果偏低，这与本次实验的结果是吻合的。研磨过程中，细胞的破碎程度、洗脱的程度以及研磨时间的长短都会因操作人员的不同而有所变化，造成对提取效率、损失程度和光解程度的影响。并且由于研磨的程度不同，为避免滤膜残片对测定吸光度的影响，需要经过多次离心，本次实验为2次离心。而冻融法只要冰冻和溶解的温度和时间一致，细胞的破碎程度不会受到人员不同的影响。并且，冻融法减少了分析人员接触丙酮的时间，保护了分析人员的身体健康；且操作简单，转移次数少，降低了样品的损失，避免了研磨中的人为误差，提高了检测的准确度和精确度。