液相色谱－串联质谱法同时测定牙膏中16种磺胺类药物残留

张 岩，马晓斐，吕 品，庞 坤，李 挥，丛 斌

（1.河北医科大学法医学系，河北 石家庄 050017；2.河北省食品质量监督检验研究院，河北 石家庄 050091）

磺胺类药物为常见抗菌剂，因其具有明显的抗感染、高效、低毒等特点，在水产养殖中被广泛使用［1－2］。然而过量使用这些抗菌剂会导致药物残留，破坏人的造血系统，造成溶血性贫血症，影响人类健康［3］。

牙膏是生活必需品，具有清洁口腔、抗感染、杀菌等功效［4－6］。我国化妆品卫生规范已经禁止在化妆品（包括口腔卫生产品）中添加磺胺类药物［7］。但某些生产企业为了片面追求口腔疾病的防治效果，向牙膏等口腔卫生产品中违规添加磺胺类药物，严重危害人们的身体健康。如果添加磺胺类药物的牙膏在口内停留的时间太长不被涮出，会发生药物残留，引起毒副反应［8－10］。

目前，磺胺类药物残留的检测方法有薄层色谱法，高效液相色谱法（HPLC）［11－14］、液相色谱－串联质谱法（LC－MS／MS）［15－17］。近年来，有关单类或多类抗生素的检测多集中于环境、食品、饲料、祛痘除螨类化妆品等样本［18］，尚未见牙膏中磺胺类药物的检测报道。本实验参考了文献［19－20］的前处理方法，采用 LC－MS／MS法测定牙膏中磺胺类药物残留，为监管部门规范管理口腔卫生产品市场提供技术支撑。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent1200－6410超快速液相色谱－三重四极杆串联质谱仪：美国 Agilent公司产品；CT15RT高速冷冻离心机：上海天美公司产品；AE200万分之一分析天平：法国 Mettler公司产品；涡旋混匀器（SK－1）：江苏中大仪器厂产品。

磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺－6－甲氧嘧啶、磺胺苯吡唑、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺吡啶、磺胺邻二甲氧嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺噻唑、磺胺甲基异噁唑、磺胺嘧啶、磺胺氯哒嗪、磺胺二甲异噁唑、磺胺甲噻二唑和磺胺醋酰标准品（纯度≥95%）：美国Sigma公司产品；乙腈（色谱纯）：美国Fisher Scientific公司产品；去离子水：由美国Millipore公司超纯水器制得。

1.2 实验步骤

1.2.1 标准储备液制备 分别将16种磺胺用甲醇配制成质量浓度为1 000mg／L储备液，使用时用乙腈稀释成所需的标准工作溶液，4℃冰箱保存。

1.2.2 牙膏样品前处理方法 称取2.5g（准确至0.001g）样品于50mL比色管中，加入V（0.1% 甲酸水溶液）∶V（乙腈）＝90∶10的溶液，定容至25mL，于涡旋混匀器上漩涡2min，于25℃水浴超声提取20min。准确量取1.0mL该样品提取溶液于100mL容量瓶中，加入V（0.1% 甲酸水溶液）∶V（乙腈）＝90∶10的溶液定容，振摇2min，静置后取约5.0mL上清液于10mL 塑料离心管中，以15 000r／min离心5min，过0.2μm 滤膜，滤液供 HPLC－MS／MS测定。

1.3 实验条件

1.3.1 液相色谱条件 色谱柱：Agilent poroshell 120SB－C18（3.0mm×100mm×2.7 μm）；流动相：0.1%甲酸水溶液（A）－乙腈（B）；流速0.3mL／min；梯度洗脱：0min、12%B，0～20min、12%B，20～20.1min、12%B～50%B，20.1～25min、50%B～100%B，25～30min、100%B～100%B，30～30.1min、100%B～12%B，30.1～37min、12%B～12%B；柱温35℃；进样量5μL。

1.3.2 质谱条件 电喷雾电离源（ESI），正离子模式扫描，多反应监测（MRM）模式，干燥气（He）温度350℃，干燥气流速12L／min，离子源温度120℃，毛细管电压4 000V，检测目标物的相关质谱参数列于表1。

表1 磺胺类物质检测质谱条件Table 1 MS／MS conditions for the detection of sulfonamide residues

2 结果与讨论

2.1 提取溶剂的选择

实验考察了不同提取溶剂（水、甲醇、乙腈、甲酸水溶液、甲醇－甲酸水溶液、乙腈－甲酸水溶液）和不同提取时间（10、15、20、25、30min）的提取回收率及提取效果。结果表明：当采用V（0.1% 甲酸水溶液）∶V（乙腈）＝90∶10的溶液为提取溶剂时，萃取的目标物对质谱检测几乎没有干扰，效果最好；当超声提取时间为20min时，各化合物的提取回收率趋于稳定，均能获得83.9%～112%的回收率。因此，实验选择V（0.1% 甲酸水溶液）∶V（乙腈）＝90∶10的溶液为提取溶剂，超声提取20min。

2.2 色谱柱的选择及分离条件的优化

本研究对比了3种色谱柱（Agilent poroshell 120SB－C18、Agilent ZORBAX SB－C18和Agilent Eclipse Plus－C18）对16种磺胺类药物的分离效果和峰形。结果表明，目标物在Agilent poroshell 120SB－C18（3.0mm×100mm×2.7μm）色谱柱上得到了最为理想的分离效果和峰形。另外，实验发现部分磺胺化合物在不同固相色谱柱上的洗脱顺序发生了改变，表现出分离选择性的差异。

本研究考察了甲醇－0.1%甲酸水、乙腈－0.1%甲酸水和10mmol甲酸胺－0.1%甲酸水混合溶剂体系作为流动相对磺胺类化合物的色谱行为和离子化程度的影响。研究表明，当流动相为乙腈－0.1%甲酸水时，仪器响应值高于其他流动相时的响应值。除了考察流动相组成外，还比较了在乙腈－水流动相体系中分别加入0.01%、0.05% 、0.1%、0.25%和0.5%甲酸对目标物响应值的影响。结果表明，以甲醇—0.1%甲酸水溶液作为流动相获得了最优的色谱分离效果和质谱信号响应。这是由于磺胺类化合物具有弱碱性，当流动相中加入一定的酸性物质（如甲酸）时，会促进磺胺的电离，并为阳离子的形成提供必需的质子来源，从而提高其离子化效率。由于16种磺胺类化合物的极性差异较大，采用等度洗脱很难将多组分磺胺同时分离测定，而采用梯度洗脱则可以较好地解决这一问题。在梯度洗脱初始阶段以低比例有机相作为流动相，将极性较强的组分先洗脱出来，然后逐渐增加有机相比例，使极性较弱的组分逐一流出色谱柱，从而实现16种磺胺类药物的有效分离。

2.3 质谱条件的优化

根据磺胺类化合物具有仲氨基或叔氨基的化学电离性质，选用ESI＋作为离子化模式，流动注射泵连续进样方式进行质谱条件优化。在正离子检测方式下对每种磺胺进行一级质谱分析，得到分子离子峰，再对每种磺胺的准分子离子峰进行二级质谱分析，得到碎片离子信息，然后对得到的二级质谱进行裂解电压、碰撞气能量优化，使每种磺胺的分子离子与特征碎片离子产生的离子对强度达到最大时为最佳。选择每种磺胺的监测离子对，将液相色谱和串联四极杆质谱仪联用，再对离子源温度、辅助气流速进行优化，使样液中每种磺胺的离子化效率达到最佳。16种磺胺标准物质的总离子流图示于图1。

图1 16种磺胺类药物标准溶液的总离子流图Fig.1 The total ion current chromatogram of 16sulfonamides

2.4 线性范围和检出限

分别配制一系列标准工作溶液，在选定的色谱质谱条件下进行测定，16种磺胺的线性方程、线性范围和相关系数列于表2。本实验采用空白样品（空白牙膏样品购于石家庄某超市，采用消炎、中草药和防过敏3类具有消炎抗菌作用的牙膏为空白基质）加标法，以3倍信噪比估算检出限（LOD），该方法检出限为2.0mg／kg。

2.5 方法的回收率和精密度

采用3类空白样品进行添加回收率和精密度实验，样品添加不同浓度后，按1.2.2操作，用液相色谱－串联四极杆质谱测定，其回收率和精密度结果列于表3。可以看出，高、中、低3个添加水平（每个浓度平行测定6次）的平均回收率在81.2%～104.7% 之间，相对标准偏差为4.1%～9.1%。

2.6 实际样品测定

采用本方法对市场上常见的16种牙膏进行测定，暂未发现有添加磺胺类药物的情况。表明目前市场上流通的主要口腔卫生用品符合《化妆品卫生规范》（2007年版）的要求，消费者可放心使用。

表2 16中磺胺类药物的线性方程和相关系数Table 2 Linear equations and correlation coefficients of 16sulfonamides

表3 16种磺胺类药物的加标回收率和精密度 （n＝6）Table 3 Recovery and precision of 16sulfonamide（n＝6）

续表

3 结论

建立了高效液相色谱－串联质谱同时检测牙膏中磺胺类（磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺－6－甲氧嘧啶、磺胺苯吡唑、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺吡啶、磺胺邻二甲氧嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺噻唑、磺胺甲基异噁唑、磺胺嘧啶、磺胺氯哒嗪、磺胺二甲异噁唑、磺胺甲噻二唑、磺胺醋酰）药物含量的方法。该方法简单快速、灵敏度高、结果准确可靠，适用于牙膏中磺胺类药物含量的检测与确证。

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