附子无姜不热的成分研究

2013-05-26郭一平

中成药 2013年5期

关键词：乌头干姜变化率

叶强，郭一平，彭成，郭力

（成都中医药大学，四川成都 611137）

附子无姜不热的成分研究

叶强，郭一平，彭成，郭力﹡

（成都中医药大学，四川成都 611137）

目的以附子与生姜、干姜、炮姜配伍前后生物碱的变化，探讨附子与干姜配伍的科学意义。方法分别采用溴甲酚绿染色法、异羟肟酸铁染色法测定附子总生物碱、酯型生物碱配伍前后的变化，结合HPLC指纹图谱研究附子与姜类药材配伍前后总体成分变化。结果附子配伍干姜使总生物碱增加，而附子配伍生姜、炮姜使总生物碱减少；附子配伍生姜、干姜、炮姜均使酯型生物碱减少，附子酯型生物碱的量为干姜＞生姜＞炮姜；从指纹图谱分析可知附子生姜配伍后，附子成分总加权变化率为115.75%，生姜为135.53%；附子干姜配伍后，附子成分总加权变化率为143.48%，干姜为72.09%；附子炮姜配伍后，附子成分总加权变化率为81.00%，炮姜为133.53%。结论附子配伍干姜能促进附子有效成分的溶出，减少附子毒性成分溶出；附子配伍生姜，降低了附子的有效成分和毒性成分，附子配伍炮姜，大幅降低附子有效成分和毒性成分。

附子；配伍；生姜；干姜；炮姜；总生物碱；酯型生物碱；指纹图谱

复方用药是中医药的特点和优势，药对，又称“对药”、是临床上常用的、相对固定的两味药物的配伍形式，是中药配伍的最小单位［1］。药对并非两味药物的随机组合，而是从历代医药学家用药经验积累中提炼出来的，其功用胜于单味药，多使药效增强，或作用全面，或减低、消除毒副作用［2］。汉代张仲景使用附子，回阳救逆必用生者与干姜作伍，后世医家亦多有应用，如干姜附子汤和四逆汤等，故有“附子无姜不热之说”［3］；温经散寒诸方，附子多配生姜，如桂枝附子汤和真武汤；《世医得效方》中炮姜与附子同用，用于脾虚冷泻和寒性吐血、便血不止之证。附子与姜类药材配伍是传统中医药理论中的经典药对，本实验以附子分别配伍生姜、干姜、炮姜为研究对象，研究配伍前后物质基础的变化，为附子配伍姜类药材传统理论提供科学诠释。

1 试剂试药与仪器设备

乌头碱（Aconitine 0720-200807，AC）、新乌头碱（Mesaconitine 0799-200403，MA）、次乌头碱（Hypaconitine 0798-200403，HA）均购自中国药品生物制品检定所；甲醇、乙腈、四氢呋喃（Fisher HPLC Grade），自制重蒸馏水，其余试剂均为分析纯。附子为毛茛科植物乌头Aconitum carmichaeliDebx.的子根切片低温干燥加工品，产地四川江油，购自四川江油恒源药业有限公司；生姜、干姜和炮姜分别为姜科植物姜Zingiber officinaleRosc.的新鲜根茎、干燥根茎和以干姜砂烫至鼓起，表面棕褐色入药炮制加工品，均产自四川犍为，购于成都新荷花饮片公司。由成都中医药大学中药鉴定教研室严铸云教授鉴定，符合药典要求。

Agilent1200型 HPLC色谱仪（DAD、Agilent工作站）、P-E紫外/可见分光光度计、Sartorius十万分之一电子天平、Buch旋转蒸发器、Dikma Dianonsil C18（250 mm ×4.6 mm，5 μm）。

2 方法与结果

附子总生物碱（TA）类成分被认为是其主要药效组分，酯型生物碱（EA）既是有效组分也是毒性组分［4］，故本实验采用溴甲酚绿染色法测定配伍前后附子总生物碱、异羟肟酸铁染色法测定附子酯型生物碱，并结合指纹图谱揭示其总体成分的变化情况。

2.1 附子总生物碱测定（溴甲酚绿染色法［5］）

2.1.1 对照品溶液的配制取乌头碱对照品约8 mg，精密称定7.78 mg，置50 mL量瓶中，加适量三氯甲烷溶解并加至刻度，摇匀，即得0.1556 mg/mL乌头碱对照品溶液。

2.1.2 标准曲线的绘制精密量取乌头碱对照品溶液0、0.5、1.0、1.25、1.5、2.5 mL，分别置于分液漏斗中，加入20 mL三氯甲烷，然后各加入10 mL pH6.1的溴甲酚绿溶液，充分振摇，静置，三氯甲烷层置于25 mL量瓶中并用三氯甲烷稀释至刻度。将乌头碱溴甲酚绿显色溶液在波长200～700 nm进行紫外全波长扫描，在415 nm处有最大吸收，故选定415 nm为测定波长。以第一份溶液为空白对照，于415 nm波长处，测定吸光度。分别以生物碱量、吸光度为横纵坐标，绘制标准曲线，得线性方程：Y=1.220 9X－0.045 5，r=0.999，线性范围为0.078～0.389 mg，方法学考察均符合要求。

2.1.3 样品测定结果见表1。

附子配伍生姜，TA变化范围为59.91%～74.45%，配伍后TA有所降低，但幅度较小；附子配伍干姜，TA变化范围为103.96% ～131.72%，配伍后TA有大幅升高；附子配伍炮姜，TA变化范围为40.29%～50.66%，配伍后TA有较大幅度降低。

2.2 附子酯型生物碱测定（异羟肟酸铁染色法［6］）

2.2.1 对照品溶液的配制取乌头碱对照品约20mg，精密称定20.4 mg，置10 mL量瓶中，加少许无水乙醇溶解，加无水乙醇至刻度，摇匀，即得2.04 mg/mL乌头碱对照品溶液。

表1 总生物碱测定结果（n=3）Tab.1 Total alkaloids content determination results about ALRP respectively compatible with ginger species herbs（n=3）

2.2.2 标准曲线的绘制精密量取乌头碱对照品溶液 0、0.25、0.5、0.75、1.5、2.0、2.5 mL，分别置25 mL量瓶中，均精密加入无水乙醇使成2.5 mL，各精密加入碱性盐酸羟铵试液1.5 mL，摇匀，在60～65℃水浴中保温10 min，放冷，加高氯酸铁试液13 mL，摇匀，放置5 min，精密加入高氯酸试液8 mL，用高氯酸铁试液稀释至刻度，摇匀，放置15 min，按紫外-可见分光光度法于200～700 nm处进行全波长扫描，在520 nm处有最大吸收。以第一份溶液为空白对照，于520 nm处测定吸光度，分别以生物碱量与吸光度为横纵坐标，绘制标准曲线，得线性方程：Y=0.091 8X－0.005 4，r=0.998，线性范围为0.51～5.10 mg，方法学考察均符合要求。

2.2.3 样品测定结果见表2。

表2 酯型生物碱测定结果（n=3）Tab.2 Ester alkaloids content determination results about ALRP respectively compatible with ginger species herbs（n=3）

附子配伍生姜，EA变化范围为50.82%～60.66%；附子配伍干姜，EA变化范围为75.41%～96.72%，降低幅度相对较小；附子配伍炮姜，EA变化范围为29.51% ～47.54%，降低幅度相对较大。

2.3 附子与姜类药材配伍指纹图谱研究由于药材中的成分相当复杂，因此本实验进一步采用指纹图谱研究，从宏观方面分析药材配伍的物质基础变化情况。为使实验条件统一可控，选择（1∶1）配伍比例作为研究对象。

2.3.1 色谱条件流动相 A为乙腈-四氢呋喃（25∶15），流动相B为0.1 mol/L醋酸铵溶液，按表3进行梯度洗脱，体积流量1 mL/min；柱温30℃；DAD检测器。

表3 梯度洗脱条件Tab.3 Gradient elution conditions

2.3.2 供试品溶液的制备分别取附子、生姜、干姜、炮姜粗粉各约5 g，再取附子配伍生姜、干姜、炮姜（1∶1）粗粉各约10 g，精密称定，按2010年版《中国药典》方法制备［7］。

2.3.3 附子配伍生姜指纹图谱研究依法测定，见图1。

图1 附子配伍生姜HPLC指纹图谱Fig.1 HPLC fingerprintsofALRP compatible fresh ginger

从图1可知，附子单煎液主要有7个特征峰，按附子药材编号顺序对峰进行编号，生姜有3个，配伍后均可检测。将附子的7个峰按峰面积进行加权，计算其加权变化率，以判断其成分的总体变化状况，同时对生姜各成分进行加权计算，见表4。

加权变化率：j=a×w

表4 附子配伍生姜后附子与生姜成分总加权变化率（%）Tab.4 ALRP＆fresh ginger components total weighted rate of variation after ALRP compatible with fresh ginger（%）

2.3.4 附子配伍干姜指纹图谱研究见图2，计算其加权变化率，见表5。

图2 附子配伍干姜HPLC指纹图谱Fig.2 HPLC fingerprints of ALRP compatible dried ginger

表5 附子配伍干姜后附子与干姜成分总加权变化率（%）Tab.5 ALRP＆dried ginger components total weighted rate of variation after ALRP compatible with dried ginger（%）

分析数据可知，附子配伍干姜后，附子各成分总加权变化率为143.48%，总体上附子成分有所增加；干姜各成分的总加权变化率为72.09%，总体上干姜成分有所减少。

2.3.5 附子配伍炮姜指纹图谱研究加权变化率见表6。图谱见图3。

表6 附子配伍炮姜后附子与炮姜成分总加权变化率（%）Tab.6 ALRP＆sand-fried ginger components total weighted rate of variation after ALRP compatible with sand-fried ginger（%）

图3 附子配伍炮姜HPLC指纹图谱Fig.3 HPLC fingerprints of ALRP compatible sandfried ginger

分析数据可知，附子配伍炮姜后，附子各成分总加权变化率为81.00%，总体上附子成分有所减少；炮姜各成分总加权变化率为133.53%，总体上炮姜成分有所增加。

3 结论与讨论

3.1 附子总生物碱附子配伍干姜使总生物碱增加，而附子配伍生姜、炮姜使总生物碱减少。附子配伍姜类药材，附子总生物碱的量为干姜＞生姜＞炮姜，这说明生姜能减少附子有效成分的溶出，从而可以降低附子辛热之性，可能使其回阳救逆和补火助阳的作用被抑制，而使附子发挥温经散寒除痹的功效；干姜能促进附子有效成分的溶出，从而保持附子辛热之性，更好地发挥附子回阳救逆的功效；炮姜能显著减少有效成分的溶出，从而使附子发挥温经、散寒除痹的功效。现代研究表明，生姜、干姜、炮姜主要含姜萜酮、β-没药烯、β-姜黄烯等挥发油成分，还含辛辣的姜辣醇、姜酮、姜酚等成分［8］，三种姜类药材成分并无特殊，但姜类药材在加工炮制的过程中加热的程度不同，可导致其成分的量有较大差异。生姜为新鲜药材挥发油损失少，也是最高的，但含水较高。干姜是生姜晒干或低温干燥产品、其水分降低，挥发油中的低沸点成分挥发减少，姜辣素类成分却是最高的。炮姜是干姜经过砂烫的加工炮制品，砂烫温度通常在150～200℃之间，使水分进一步蒸发，同时其所含挥发油中的高沸点成分也会挥发损失，姜辣素类成分也会破坏降低。本实验中，姜类药材与附子配伍时，只有干姜使总生物碱增加，可能是其水分较少，所含高沸点挥发油和姜辣素起到了增溶的作用。张宇等研究表明附子干姜合煎液中乌头类生物碱含有量增至36.40%，可能是干姜中所含的高分子化合物有增溶作用［9］。总生物碱的测定结果表明传统论述“附子无姜不热”，这里所说的“姜”应为干姜，而非生姜、炮姜。展海霞等实验证明［10-11］，干姜与附子相伍可改善冠脉血流量，加快心率，改善心衰大鼠血流动力学。同时，干姜可明显拮抗附子对心脏毒性、减少心肌能量需求，达到回阳救逆目的。

3.2 附子酯型生物碱附子配伍生姜、干姜、炮姜均使酯型生物碱减少，附子酯型生物碱的量排序为干姜＞生姜＞炮姜。这说明生姜能减少附子毒性，也降低附子辛热之性，诚如传统配伍理论所指生姜杀附子之毒；干姜使附子酯型生物碱含有量有所减少，但降低幅度相对较小，与文献一致［12］，由于酯型生物碱既是附子的热性成分又是毒性成分，因此与干姜配伍既有减毒的作用又有调节附子药性的作用；炮姜能显著减少酯型的溶出，从而大幅度降低毒性，也大幅度减少附子辛热之性。越皓等采用HPLC-MS对干姜配伍附子进行分析，得出干姜成分与附子双酯型生物碱反应生成单脂型生物碱，且抑制了双酯型生物碱的溶出，从而达到解毒的目的［13］。故生姜、干姜、炮姜均可解附子之毒，抑制附子毒性。

3.3 指纹图谱附子配伍生姜后，附子各成分总加权变化率为115.75%，附子总体成分有所增加，可使附子发挥其温里散寒的作用；生姜各成分总加权变化率分别为135.53%，生姜总体成分大幅上升，这主要是促进了生姜挥发油的溶出，从而保持生姜发汗解表的作用。附子配伍干姜后，附子各成分总加权变化率为143.48%，附子总体成分有较大幅度增加，促进附子中成分的溶出从而发挥附子的回阳救逆的作用，这与张丽等的研究结果相类［14］，从另一方面说明“附子无姜不热”是指附子配伍干姜；干姜各成分总加权变化率为72.09%，总体上干姜成分有所减少。附子配伍炮姜后，附子各成分总加权变化率分为81.00%，附子总体成分有所减少，使其不致太过辛热；炮姜各成分总加权变化率为133.53%，炮姜总体成分也大幅增加，可能是炮姜在炮制过程中，成分大幅下降导致基数较低，而且炮制后更容易溶出。

3.4 问题与展望一般来说，大多数中药，都有两种或两种以上的功效，适应证多，治疗范围广。如果适当配伍另一种药物，直接或间接地促进某一功能的发挥，或抑制某些不良作用，有利于提高临床疗效［2］，附子与姜类药材配伍正是体现了传统的调控思想。本实验从配伍前后物质基础的变化进行了研究，然而这只是其中一方面，其体内代谢过程还不清楚，因此应该更进一步进行药效学的深入研究加以完善［15］。

［1］彭成.中药药性理论的科学基础［A］//北京：中华中医药科技成果论坛，2004.

［2］胥庆华.中国药对大全［M］.北京：中国中医药出版社，1996：3-89.

［3］（清）黄宫绣.王淑民校注.本草求真：卷三［M］.中国中医药出版社，1999.

［4］陈信义，李峨，候丽，等.乌头类生物碱研究进展与应用前景评述［J］.中国中医药信息杂志，2004，11（10）：78-79.

［5］叶强.附子配伍大黄调控药性物质基础研究［D］.成都：成都中医药大学，2005.

［6］国家药典委员会.中华人民共和国药典：2005年版一部［S］.北京：化学工业出版社，2005：122-123.

［7］国家药典委员会.中华人民共和国药典：2010年版一部［S］.北京：中国中医药科技出版社，2010：177-178.

［8］郝孝波.HPLC测定干姜、生姜和炮姜中6-姜酚的含量［J］.黑龙江科技信息，2011（2）：5-6.

［9］陈长勋，徐姗瑁.甘草、干姜与附子配伍减毒的物质基础与作用环节研究进展［J］.中药新药与临床药理，2006，17（6）：472-476.

［10］展海霞，彭成.附子与干姜配伍对心阳虚衰大鼠血浆肾上腺素、血管紧张素Ⅱ、醛固酮及ANP、NT的影响［J］.中药药理与临床，2006，22（2）：12-14.

［11］展海霞，彭成.附子与干姜配伍对心衰大鼠血流动力学的影响［J］.中药药理与临床，2006，22（1）：42-44.

［12］奚丽君，卫平.附子与干姜配伍增效减毒作用机制研究概述［J］.实用中医药杂志，2008，24（9）：608-610.