Box-Behnken响应面法优化黄芩素微丸的缓释包衣处方

沈 熊， 梁 健， 黄廼奇， 杨春欣， 吕迁洲

(复旦大学附属中山医院药剂科，上海200032)

黄芩素 (Baicalein)异名:黄芩苷元，黄芩黄素，为唇形科Labiatae黄芩属Scutellaria多年生草本中药植物黄芩Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根中提取的黄酮类化合物，是黄芩的最主要活性成分之一，具有抗菌、抗病毒、抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗纤维化及心脑血管、神经元保护等药理作用，提示黄芩素具有多层次、多途径、多靶点的药理活性作用［1］。黄芩素在胃和小肠中吸收良好，在结肠中有少量吸收，提示适宜制成缓控释制剂［2，3］。微丸作为多单元剂型，具有受生理因素影响小、胃肠道分布广、释药变异小等优点，因此是缓控释和靶向制剂的优良剂型［4］。

Eudragit RS与Eudragit RL属于水不溶性成膜材料，在水中可溶胀，Eudragit RS比Eudragit RL渗透性和溶胀性小，将二者配合使用，可有效调节包衣型缓释制剂的释药速率［5］。本研究应用Box-Behnken试验设计法优选出释放效果理想的缓释包衣处方，并检验模型的预测性。

1 材料与仪器

黄芩素原料 (陕西慈缘生物技术有限公司)，黄芩素对照 (中国食品药品检定研究院，批号1115952200604);微晶纤维素丸芯 (Celphere 507，日本旭化成公司);Eudragit RS 30D与Eudragit RL 30D(上海罗姆公司药用树脂部);聚乙烯吡咯烷酮 (PVP K29/32，国际特品公司);羟丙甲纤维素 (HPMC，6cps，上海卡乐康包衣技术有限公司);柠檬酸三乙酯 (TEC，美国Morflex公司)，甲醇、乙腈为色谱纯，其它试剂均为分析纯。

气流粉碎机 (JGM-H50型，华东理工大学)，流化床包衣机 (GPCG 1，Glatt，德国);智能溶出仪 (ZRS-4型，天津大学无线电厂);Agilent 1200高效液相色谱系统 (美国)。

2 方法和结果

2.1 黄芩素缓释微丸的制备

2.1.1 载药微丸的制备 用气流粉碎机对原料药物进行微粉化。以25%PVP水溶液为黏合剂，搅拌下将微粉化的黄芩素 (粒径2～10 μm)分散于其中制成混悬液。将空白丸芯至于包衣机中，采用底喷法，丸芯在流化状态下预热5 min，工艺条件见表1，包衣过程中需对包衣液持续搅拌。包衣完成后，再包一层HPMC层作为隔离层，增加质量2%。

表1 黄芩素载药微丸和缓释微丸制备工艺参数Tab.1 Process parameters for baicalein layering and the sustained release coating of layered pellets

2.1.2 缓释微丸的制备 分别称取Eudragit RS 30D与Eudragit RL 30D两种水分散体，按预定比例混合，加水适量，搅匀。将滑石粉、柠檬酸三乙酯和消泡剂 (甲基硅油)加入适量水中，混匀。将此混悬液缓慢倒入上述水分散体中，搅匀，过80目筛，即得缓释包衣液。取黄芩素载药微丸适量至于包衣机中，采用底喷法，按表1工艺参数制备，包衣结束后同样包一HPMC隔离层。

2.2 黄芩素缓释微丸含量测定方法

2.2.1 色谱条件 Phenomenex Luna C18色谱柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为0.05%三氟乙酸-乙腈-甲醇 (55∶20∶25);体积流量 1.0 mL/min;检测波长272 nm;柱温30℃，进样量20 μL。

2.2.2 测定方法 取黄芩素对照品适量，精密称定，加流动相制成每1 mL含500 μg的溶液，作为对照品溶液。取黄芩素微丸适量，研细，精密称取细粉500 mg(约相当于黄芩素5 mg)，置10 mL量瓶中，加流动相9 mL，超声处理30 min，加流动相稀释至刻度，混匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，作为供试品溶液。

取对照品溶液和供试品溶液，按2.2.1项下操作，记录色谱图，按外标法以峰面积计算。

2.3 黄芩素缓释微丸体外释放度测定

2.3.1 标准曲线的制备 精密吸取上述对照品溶液2、10、20、30、40 μL进样，按上述色谱条件测定其峰面积值。以峰面积值X对进样量Y(μg)进行回归，得回归方程为Y=64696X+5689，r=0.9999(n=5)，表明黄芩素进样量在1.00～20.00 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.3.2 精密度试验 精密吸取对照品溶液20 μL，于同日内连续进样6次，记录峰面积，黄芩素的RSD为0.82%(n=6)。

2.3.3 稳定性试验 取同一供试品溶液分别于0、2、4、6、8、12 h进样20 μL，记录峰面积，黄芩素的RSD为2.83%，表明处理后的样品溶液室温放置12 h内稳定性良好，符合实验测试要求。

2.3.4 重复性试验 取微丸 (批号120117)研匀，精密称取6份，每份约500 mg，按2.2.2项下方法制备，再按2.2.1项下的色谱条件测定，黄芩素的RSD为1.60%。

2.3.5 加样回收率 精密称取2.3.4项下已测定含量的微丸6份，每份约500 mg，精密加入对照品适量，按2.2.2项下方法制备，再按2.2.1项下的色谱条件测定，黄芩素的平均回收率为98.21%，RSD为1.92%。

2.3.6 体外释放度测定 根据中国药典2010年版二部附录X D第一法，采用溶出度测定法 (附录X C)第一法的装置，称取黄芩素微丸适量 (含黄芩素约10 mg)，以脱气的新鲜纯化水900 mL为介质，温度为 (37±0.5)℃，转速为75 r/min，依法操作，分别于2、6、12 h取样5 mL，同时补充(37±5)℃同体积的释放介质，样品经0.45 μm微孔滤膜滤过，测定含量，计算累积释放度。

2.4 Box-Behnken设计-响应面法优化缓释微丸处方

2.4.1 Box-Behnken设计 在单因素考察的基础上，选取对缓释微丸系统释药影响较明显的3个因素，即增塑剂 (TEC)在包衣液中的质量分数、聚合物比例 (Eudragit RS 30D:Eudrgit RL 30D)以及包衣增重，分别记为X1、X2和X3，在3个水平上进行了优化研究，以2、6、12 h的释放度为响应值，分别记为Y1、Y2和Y3，建立数学模型，优化黄芩素缓释微丸处方。试验中每个因素的3水平分别记作-1、0、+1，见表2，试验设计及结果见表3。

表2 Box-Behnken设计的因素和水平Tab.2 Independent variables:factors and their levels for Box-Behnken design

表3 Box-Behnken设计及响应值Tab.3 Experimental runs and observed values of responses for Box-Behnken design

其中，Adj.R2为校正后的决定系数 (Adjusted R-Squared)，结果表明，缓释微丸在2、6、12 h的释放度与增塑剂质量分数、聚合物比例、以及包衣增重三因素各水平的非线性拟合效果较好，相关系数较大 (Adj.R2＞0.94)。

2.4.3 处方优化和预测 应用Design Expert 7.0进行拟合作图，得响应面图和等高线图，可直观反应各因素和响应值、以及各因素之间的交互作用，以响应值Y2为例，列举了各因素和响应值的三维图。

为了确定黄芩素缓释微丸优化模型的取值区域，根据缓释制剂指导原则，对3个取样点的释放度分别设定目标范围，其中2 h为10%～30%，考察药物是否有突释;6 h为40%～60%，用于确定释药特性;12 h为90%以上，用于考察释药是否基本完全，此3点可用于表证体外缓释制剂药物释放度［6］。经Design Expert7.0软件计算，得到最优处方为:X1为11%，X2为4%，X3为12%，响应值的预测值分别为:Y1为28.34%，Y2为58.56%，Y3为95.00%。

2.4.4 验证性试验 根据上述最优处方组成，增塑剂柠檬酸三乙酯在包衣液中的质量分数为11%，聚合物比例 (Eudragit RS∶Eudragit RL)为4∶1，包衣增重为11%，按表1工艺参数制备3批黄芩素缓释微丸，考察释放度，得3个指标的实测值，将实测值与预测值比较，根据以下公式计算偏差:偏差=(实测值-预测值)/预测值×100%，偏差越小，表明所建立的模型预测性越好。结果见表4。结果显示制得微丸的释放度实测值与预测值基本一致，说明所建立的拟合模型具有较高的可靠性，预测性良好。

各因素与响应值 (Y2)的三维图见图1。

2.4.2 Box-Behnken设计-响应面法优化试验结果运用Design Expert 7.0，经多元线性及非线性回归处理并适当简化，得拟合方程:

表4 预测值与实测值的偏差Tab.4 Bias between predicted and observed values

3 讨论

图1 各因素与响应值 (Y2)的三维图Fig.1 Three-dimensional response surface plot showing effect of independent factor Y2 on response values

本实验制备的黄芩素缓释微丸，体外释放度主要取决于包衣液中增塑剂质量分数、包衣液中聚合物比例、以及包衣增重。通过Box-Behnken设计-响应面优化，得到最优处方，制得包衣微丸可以达到缓释的目的。根据参考文献［7，8］，采用高效液相色谱法测定缓释微丸中黄芩素的量和释放度，方法准确、简便、重现性好。

Box-Behnken试验设计法是响应面设计法的一种，它可以提供多因素、三水平的实验设计及分析，目前已被广泛的应用于中药提取［9］和药物制剂处方筛选和优化［10，11］等药学研究领域。

评价模型拟合度时，向模型中增加没有统计学意义的变量，决定系数R2值仍会增大，校正后的决定系数 (Adj.R2)克服了自变量个数的影响，当模型中增加的变量没有统计学意义时，校正决定系数会减小，计算公式如下:

其中，n为观测值个数，p为解释变量个数，Adj.R2越大，模型拟合越好［12］。

为简化方程求解，在保证拟合度的前提下，进行了相应的方程简化。以响应值Y1为例，拟合得到完整的二次多项式为:Y1=116.02-3.05X1-9.47X2-4.00X3+0.06X1X2+0.01X1X3+0.13X2X3+0.05X12+0.48X22+0.06X32，P ＜ 0.0001。根据方差分析结果，除X1X2项和X1X3项外，其余各项均为显著项 (P＜0.05)或以上，本实验在置信度P=0.05水平上简化方程，舍去P＞0.05的项，得到简化的拟合方程为 Y1=107.13-2.60X1-8.34X2-3.74X3+0.13X2X3+0.05X12+0.48X22+0.06X32，R2=0.9896，P ＜0.05，同理简化了Y2和Y3两个响应值的拟合方程，并验证简化模型的预测性，结果显示预测准确可靠。上述结果显示，Box-Behnken设计-响应面法具有良好的预测性，可有效应用于黄芩素缓释微丸的处方筛选和优化。

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