结肠康对恶唑酮诱导的小鼠溃疡性结肠炎的作用

关丽华，商亚珍 （承德医学院中药研究所／河北省中药研究与开发重点实验室，河北 承德 067000）

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是一种原因不明的非特异性炎症，病变发生于大肠，呈连续弥漫性分布，多数累及直肠和乙状结肠，其典型的临床过程包括黏液脓血便和腹痛腹泻，病程长、反复发作。大多学者认为与肠壁黏膜组织内免疫调节功能异常、持续的肠道感染、肠壁黏膜屏障缺损、遗传、精神和环境因素等有关［1］。恶唑酮（oxazolone，OXZ）诱导的溃疡性结肠炎模型，动物出现懒动、体质量减轻、稀便或血便等症状，与临床UC患者表现接近。OXZ诱导的肠炎是由Th2型细胞介导的，组织炎症具有UC的病理特征［2］。UC在我国发病率较欧美低，但近年来，其发病率有增加趋势。临床上以激素、磺胺药和免疫调节抑制剂药物治疗，但不良反应较多［3］。

中药复方结肠康是多年在临床应用治疗溃疡性结肠炎的经验方。是由藿香、炒白术、茯苓、柴胡、三七粉、抗芍、白芨、黄连、甘草、元胡等19味中药组成，根据中医理论，该组方具有化湿和中、益气健脾、清热燥湿、温中涩肠、活血止痛之功效，本组方多成分，可能多靶点调节起效，临床96例UC患者结肠康治疗总有效率100%，近期治愈率50%［4］。复方结肠康对课题组前期实验中建立的葡聚糖和三硝基苯磺酸UC模型小鼠也具改善结肠炎症状，减轻结肠组织炎症的作用［5－6］。本实验从 OXZ诱导小鼠UC模型研究中探讨结肠康治疗溃疡性结肠炎的药效学作用。

1 材料

1.1 实验动物与试剂 SPF级昆明种小鼠，120只，7～8周龄，♀♂各半，体质量22～24 g，河北医科大学试验动物中心提供（动物质量合格证编号：1006001）；OXZ购自Sigma公司；结肠康本实验室自制；SASP（上海信宜嘉华药业有限公司）。

1.2 结肠康的配制 方中药材，总量210g（三七粉除外），置于1 000mL烧杯中，加适量纯化水浸泡30min，煮沸后微沸30min，滤出头煎，药渣加适量水煮沸后微沸30min，滤出二煎，合并两次煎液静置沉淀后加热浓缩至160mL，温度降至室温后加三七粉研磨均匀，结肠康药液浓度为每毫升含生药1.28 g。

2 方法

2.1 动物模型及药物干预方法 120只昆明小鼠，其中10只作为空白对照，其余110只小鼠参考Heller等［7］方法建立OXZ诱导结肠炎模型。小鼠颈背部皮肤剃毛（2 cm×2 cm），3%OXZ的纯乙醇溶液0.2 mL滴在小鼠皮肤上，自然风干，24 h后重复致敏一次；致敏5 d后灌肠，灌肠前小鼠禁食24 h。小鼠乙醚吸入麻醉，观察活动和呼吸等指标，切忌麻醉过深。麻醉后，用直径2 mm硅胶管钝头插入小鼠肛门约4 cm，用1 mL注射器抽取0.15 mL 1.5%OXZ50%乙醇溶液，顺硅胶管注入小鼠肛门，速度不宜过快，完成后倒提鼠尾60s，防止回流，使溶液完全吸收。空白对照组不加OXZ同样处理。小鼠进食减少、体质量减轻、毛色无光泽、懒动、活动量减少、出现稀便或血便被认为造模成功。

OXZ造模成功小鼠随机分为5个组，模型组、结肠康（6.4、12.8、25.6 g·kg－1）组和SASP（0.2 g·kg－1）组。药物干预组小鼠每日灌胃给予相应药物，空白对照组和模型组灌胃给予纯化水，灌胃容积为0.2 mL·（10g）－1体质量，正常饲养，每日观察小鼠体重、活动度、毛色、大便性状等情况，参照Hamamoto等标准［8］，计算DAI评分。DAI为每只小鼠体质量增加的分数与小鼠大便性状的分数、小鼠粪便隐血分数之，DAI评分越高说明小鼠结肠炎炎症程度越重。具体评分标准见表1。

2.2 小鼠结肠大体损伤评价 第3天灌胃1 h后断头法处死小鼠，将小鼠固定于鼠板上，75%酒精消毒腹部皮肤，沿腹中线逐层剪开腹部组织，自回盲部剪断，冰PBS充分洗涤，沿肠壁长轴纵向剪开结肠，用预冷无菌生理盐水冲洗干净，肉眼观察肠黏膜的病变，记录溃疡个数，测量溃疡面积，估算溃疡面积占受损面积百分比，并根据结肠黏膜的色泽、溃疡、糜烂、充血、出血点等情况，按照Ekstrom评分标准［9］进行大体损伤评分，见表2。

表1 结肠DAI评分标准Tab 1 Evaluation score of disease active index

表2 OXZ诱导小鼠结肠炎大体损伤评分标准Tab2 Macroscopic scoring system of oxazolone－induced colitis

2.3 小鼠结肠病理评价 取结肠组织，以4%中性甲醛固定，常规水洗、脱水、浸蜡包埋，5μm厚度切片，常规HE染色，光镜下观察其溃疡、杯状细胞和淋巴细胞浸润等。

2.4 统计学处理 采用SPSS11.5统计软件包统计学处理，计算相关系数及假设t检验进行直线相关回归分析；组间多样本均数间比较采用单因素方差分析（one－way ANOVA），P＜0.05认为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 结肠康对结肠炎小鼠DAI的影响 见表3。正常组小鼠毛色光亮，体质量逐渐增加，进食好，活动灵活；模型组小鼠体质量明显下降、厌食，毛色干枯，精神差，体型消瘦，部分小鼠表现稀便或不成形肛周粘便，粪便隐血阳性或便血；结肠康低剂量组小鼠毛色、活动度及进食情况明显好于模型组小鼠，高剂量组和SASP组小鼠状态与正常小鼠接近。与正常组相比，模型组DAI评分明显增高（P＜0.01）；结肠康25.6 g·kg－1组和SASP组 DAI评分与正常组无明显区别（P＞0.05），显著低于模型组（P＜0.01）。

3.2 对死亡率的影响 空白对照组小鼠全部存活，模型组小鼠19只，死亡12只，死亡率63.16%；结肠康6.4 g·kg－1组小鼠16只，死亡7只，死亡率43.75%；结肠康12.8 g·kg－1组小鼠17只，死亡5只，死亡率29.41%；结肠康25.6 g·kg－1组小鼠17只，死亡7只，死亡率41.18%；SASP组小鼠16只，死亡7只，死亡率43.75%。见表3。

表3 结肠康对小鼠DAI评分、死亡率和大体损伤评分的影响（，n＝7）Tab 3 The effect of Jiechangkang on macroscopic scoring of mice with experimental colitis、mortality rate and evaluation score of disease active index（，n＝7）

表3 结肠康对小鼠DAI评分、死亡率和大体损伤评分的影响（，n＝7）Tab 3 The effect of Jiechangkang on macroscopic scoring of mice with experimental colitis、mortality rate and evaluation score of disease active index（，n＝7）

注：与模型组比较，aP＜0.05，bP＜0.01

大体损伤38模型组 8.4±1.8 63.16（12／19） 3.29±0.76结肠康6.4 g·kg－15.6±1.5b43.75（7／16） 1.86±0.90b 12.8 g·kg－14.6±1.0b29.41（5／17） 2.0±0.82b 25.6 g·kg－12.0±0.8b41.18（7／17） 0.86±0.69b SASP0.2 g·kg－12.4±1.4b43.75（7／16） 1.0±0.21得分空白对照组 0.9±0.7 0（0／10） 0.14±0.分组 DAI评分 死亡率／%（死亡只数／动物只数）b

3.3 对结肠大体损伤的影响 图1和表3结果显示，小鼠结肠大体解剖可见，正常小鼠结肠颜色呈淡红色，肠腔内粪便成形（图1A）；模型组小鼠结肠肠壁变薄，肠腔内可见粪便不成形，部分小鼠肠腔内有暗红色血便（图1B）；其余各组结肠炎症均有不同程度缓解，肠腔出血少见，粪便基本成形（图1C／D／E／F）。大体损伤评分表明，正常对照组小鼠结肠均匀细长，没有出血点，模型组小鼠结肠充血、肠壁变薄、有溃疡存在。模型组结肠溃疡个数较多和面积较大，结肠康25.6 g·kg－1组和SASP组溃疡个数和面积明显减少。与正常对照组比较，模型组大体损伤评分均明显增高（P＜0.01）；SASP组和结肠康各剂量组结肠大体损伤评分均有不同程度的降低（P＜0.01或P＜0.05），且结肠康25.6 g·kg－1组与SASP组比较，差异无显著性（P＞0.05），结肠康浓度与大体损伤评分进行直线相关分析，r＝－0.9011，假设检验t＝－4.1566，P＝0.0142，P＜0.05，提示结肠康可剂量依赖性有效治疗结肠炎。

3.4 对结肠病理损伤的影响 见图2。正常组小鼠结肠腺体结构完整，排列整齐，间质分布均匀（图2A）；模型组可见溃疡、组织明显水肿及腺体排列较乱，局部肠上皮腺体层数较少或缺失，上皮增生伴轻、中度非典型增生、间质充血及大量炎性细胞浸润，（图2B）。结肠康6.4 g·kg－1和12.8 g·kg－1组也可见溃疡，仍有较明显的组织水肿和大量炎性细胞浸润，结肠康25.6 g·kg－1组及SASP组溃疡较少，并可见已愈合的溃疡组织，组织水肿和充血明显减轻，炎性细胞浸润明显减少（图2C／2D／2E／2F）。

4 讨论

图1 结肠康对结肠炎小鼠结肠大体形态改变的影响A.正常对照组（结肠颜色呈淡红色，肠腔内粪便成形）；B.模型组（结肠肠壁变薄，肠腔内可见粪便不成形，部分小鼠肠腔内有暗红色血便）；C～E.结肠康25.6、12.8、6.4 g·kg－1组（结肠炎症均有不同程度缓解，肠腔出血少见，粪便基本成形）；F.SASP组（阳性对照药物组，结肠炎症缓解，粪便成形）Fig 1 Photos of colon in various groupsA.normal group（the color of colon was pink and stool was normal）；B.model group（the colon wall was thin，there were loose stools in some mice，and dark red blood stools in others）；C－E.Jiechangkang（6.4，12.8，25.6 g·kg－1）group，the colonic inflammation was inhibited by three doses of Jiechangkang at varying degrees；the intestine bleeding was reduced and the form of stool was close to the normal；F.SASP group

图2 结肠康对小鼠结肠炎病理改变的影响（HE染色，×200）A.正常对照组（肠腺体结构完整，排列整齐）；B.模型组（溃疡、组织明显水肿及腺体排列较乱，间质充血及大量炎性细胞浸润）；C～E.结肠康6.4、12.8、25.6 g·kg－1组（结肠组织可见不同程度组织水肿和充血减轻，炎性细胞浸润减少）；F.SASP组（阳性药对照组，结肠组织水肿和充血较轻，炎性细胞浸润明显减少）Fig 2 Effects of Jiechangkang on the histology of colonic mucosa of mice with experimental colitis（HE，×200）A.ormal group（the colon glands＇structure was intact and neat）；B.model group（tissue was edema，ulcer was serious and glands arranged chaos with massive infiltration of inflammatory cells in interstitial）；C－E.Jiechangkang（6.4，12.8，25.6 g·kg－1）group.（colon tissue edema to varying degrees and congestion diminished，inflammatory cells reduced）；F.SASP group（colon tissue edema and congestion reduced to varying degrees.Inflammatory cells were significantly reduced）

溃疡性结肠炎是一种临床常见的慢性炎症性肠病，主要表现为腹痛、腹泻、脓血便、里急后重等，病程长，病情轻重不一，常反复发作［10］。在我国发病率较欧美低，但近年来，其发病率有逐年增加趋势。现代医学认为UC发生与免疫、遗传等很多因素有关，常用治疗药物有氨基水杨酸类、免疫抑制剂和激素类等，但是其有不良反应多、停药后易复发等弊端。UC属于中医学的痢疾、泄泻、肠癖、滞下、肠风、脏毒等范畴，以腹痛、腹泻、粘液脓血便、里急后重等为主要症状，伴乏力、发热、进行性消瘦等全身症状。中医学认为其多由外感六淫之邪，内伤七情、劳倦过度及饮食不节所引起，其病因病机多由素体脾胃损伤、传导失司、郁久化热、水湿内停、湿热蕴肠、肠络受损、血腐肉败化为脓血，从而形成本虚标实、寒热错杂之证［11］。中医药治疗UC具有临床疗效好、复发率低、不良反应少等优点［2］，日渐成为研究的热点。

OXZ是一种半抗原，可以在动物机体各个部位诱发接触性过敏反应。Heller等［2］研究发现，OXZ诱导的UC是一种IL－4介导的辅助性Th2型炎症，其组织学特征和炎症分布均类似于人类UC［12］。中药复方结肠康是多年在临床应用治疗溃疡性结肠炎的经验方。是由柴胡、三七粉、藿香、炒白术、茯苓等19味中药组成，根据中医理论，方中黄芪、白术健脾益气、燥湿、托毒生肌，茯苓利水渗湿；黄连清热燥湿、止痢养血，三七具有散瘀止血，消肿定痛之功效；现代医学亦证实，白术、白芍、黄连等均有抗炎、抗病毒作用，从而有利于祛除本病的感染因素。临床试验证明，96例患有UC患者中，服用结肠康汤剂30d，临床症状基本消失，结肠镜检查发现黏膜轻度炎症或假息肉形成为治疗有效者，有效率达100%［4］。本试验参照Heller的造模方法，先用3%OXZ皮肤致敏后再经肛门注入1.5%OXZ建立结肠炎模型；小鼠在灌肠后出现体质量下降、稀便、血便、毛发干枯、饮食减少、懒动等症状；病变主要累及远端结肠，病理表现可见黏膜充血、溃疡和糜烂，病变局限于黏膜层和黏膜下层，有大量淋巴细胞和中性粒细胞浸润，与人类UC的病理改变相似。研究结果表明，结肠康6.4、12.8、25.6 g·kg－1药物干预后可明显改善OXZ诱导小鼠结肠炎的症状，降低小鼠死亡率，降低小鼠的DAI和结肠大体损伤评分，改善结肠组织病理变化，减轻炎症反应程度，且其呈剂量依赖性，提示结肠康对OXZ诱导小鼠溃疡性结肠炎具有一定的治疗作用。结肠康6.4、12.8、25.6 g·kg－1组小鼠死亡率中12.8 g·kg－1组小鼠死亡率最低，和中药复方药材多，成分复杂，存在一些不确定成分，可能会出现大剂量药物毒性增加，作用效果降低而成倒U型，为药物今后进一步研究提供思路。

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