高效液相色谱－荧光法测定大鼠体内金丝桃素血药浓度及其药动学

姚婷婷，章礼久，方海明，夏泉，朱丽丽，杨姣 （.安徽医科大学第二附属医院消化内科，安徽 合肥 3060；.安徽医科大学第一附属医院药剂科，安徽 合肥 300）

贯叶连翘（Hypericum perforatumL.）为藤黄科金丝桃属多年生草本植物，是国际医药市场上最重要的治疗轻、中度抑郁症的植物制剂原料，萘骈二蒽酮类化合物金丝桃素（Hypericin，Hyp）是贯叶连翘中最具有生物活性的物质，具有光敏性，易溶于吡啶和其他有机胺类［1］，是贯叶连翘抗抑郁的有效成分。在欧洲，尤其在德国长期用作抗抑郁药物［2－5］。近年来在抗病毒及癌症的光动力学治疗方面有着十分活跃的研究，具有重要的新药开发价值［6］。贯叶连翘主要分布于我国西南、西北如：河北、河南、陕西等省，生于山区河从草地，山坡和灌丛中。目前国内有关Hyp相关研究主要集中于Hyp分离提取、含量测定及药效学，而Hyp药动学相关研究较少，本试验拟建立大鼠血浆内Hyp浓度高效液相法，并初步探讨Hyp静脉药动学特点。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器与试剂 日本岛津LC－20AT系列全自动高效液相色谱仪，RF－10A XL荧光检测器，LC solution数据采集处理工作站（日本岛津），TU－1800STC紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器公司）；TGL－16R高速冷冻离心机（珠海黑马医学仪器有限公司）；JK300B超声波清洗器（合肥金尼克机械制造有限公司）；HealForceCROB超纯水机（HealForce力康公司）、氮吹仪、WH－2微型漩涡混合仪（上海沪西分析仪器厂有限公司）。Hyp对照品（成都普瑞法科技开发有限公司，纯度98%，批号548－04－9），甲醇、乙腈均为色谱纯，磷酸二氢钠为分析纯。

1.1.2 实验动物 Wistar大鼠，♀♂雌雄各半，平均体质量为（250±5）g，购于安徽长临河医药科技有限公司［许可证号：SCXK（皖）2007－001］。

1.2 方法

1.2.1 Hyp储备液制备 精密称取Hyp对照品溶于甲醇－吡啶（9∶1）混合液中并进行超声溶解，配制成10μg·mL－1储备液。

1.2.2 色谱条件 色谱柱：大连依利特Kromasil C18柱（5μm，4.6 mm×200mm）；流动相：甲醇－乙腈－1%磷 酸 二 氢 钠 （65∶30∶5）；流 速：1.0mL·min－1；柱温40℃；荧光检测激发波长315 nm、检测波长590nm；进样20μL。

1.2.3 大鼠血浆生物样品处理 参考文献［7］并改良，精密取大鼠血浆100μL，加入300μL甲醇－吡啶（9∶1）混合液后，涡旋振荡1 min，14 000r·min－1离心3 min，后取上清液57℃氮气吹干，加入200μL流动相溶解残渣，再次涡旋振荡1 min，14 000r－1·min离心3 min，取上清液20μL进样分析。

1.2.4 Hyp标准曲线的建立 精密吸取上述储备液适量，分别加入100μL大鼠空白血浆样品，使Hyp血浆样品终浓度分别为5、10、25、100、250ng·mL－1。采用上述处理方法处理血浆后，取样20μL进样测定。记录样品峰面积，对血浆药物浓度进行线性回归，得到血浆样品的线性回归方程。

1.2.5 精密度和回收率 分别取浓度为5、25、250ng·mL－1Hyp血浆样品，在1 d内处理测定5次，并连续5 d分别提取测定，计算日内和日间差异。分别取上述3种浓度的血浆样品，在同1 d内提取，测定，将测定结果代入标准曲线方程，计算回收率。

1.2.6 静脉给药后Hyp在大鼠体内血药浓度 取健康成年大鼠6只，♀♂各半，实验前12 h禁食，自由饮水，经静脉［8－9］给予100μg·kg－1Hyp，于给药前及给药后1、5、10、20、30、40、60、90、120、180min取颈动脉血0.3 mL。12 000r·min－1离心3 min，取上清液100μL按照“1.2.3”方法处理血浆样品后，取上清液－80℃冻存，HPLC测定血药浓度。

1.3 数据处理 血浆药物浓度－时间曲线（C－t）下面积（AUC）、半衰期（t1／2）、清除率（CL）等参数采用DAS2.0药动学软件分析。

2 结果

2.1 方法专属性 大鼠空白血浆、空白血浆加对照品及给药后血浆样品色谱图见图1，Hyp保留时间为6.5 min。在此实验条件下内源性物质不干扰样品测定，方法专属性较好。

2.2 标准曲线及线性范围 取5、10、25、100、250ng·mL－1系列浓度Hyp血浆样品分别进样，测定峰面积，以峰面积（Y）为纵坐标，以对应的Hyp含量（X）为横坐标，绘制标准曲线，回归方程为：Y＝25997 X－77321，r＝0.9991。

2.3 精密度和回收率 5、25、250ng·mL－1Hyp血浆样品所测日内、日间变异系数及回收率见表1。

表1 大鼠血浆内Hyp日内、日间变异系数及回收率Tab 1 Accuracy and recovery rate of the HPLC method for the analysis of the hypericin in serum of rats

2.4 静脉给药后血浆药动学参数 静脉给药后C－t曲线见图2，AUC0－t为（224.16±28.78）μg·L－1·h，t1／2为（4.283±2.68）h，CL为（0.196±0.08）L·h－1·kg－1。

图2 静脉给予 Hyp 100μg·kg－1后的浓度－时间曲线（n＝6）Fig 2 Mean plasma concentration－time profiles of hypericin（100μg·kg－1）after intravenous administration（n＝6）

3 讨论

Hyp属于萘并二蒽酮类化合物，不溶于水，易溶于吡啶和其他有机胺类，预实验发现Hyp在甲醇－吡啶（9∶1）混合溶液中溶解度较好，同时利用超声波技术使其溶解更加充分。Rückert等［10］采用电化学检测法检测，试验操作过程复杂，需调pH值Hyp保留时间为12 min；B.Isacchi等［11］采用二极管阵列检测器检测，流动相进行梯度洗脱耗时长。综合考虑由于Hyp生物样品浓度较低，采用紫外检测方法其灵敏度较低，与其他检测方法相比，采用荧光检测法测定Hyp血浆浓度灵敏度高，专属性强。另外，鉴于Hyp具有光敏性，试验及保存过程中应注意避光。

静脉注射Hyp后，其体内药动学特征符合二室模型，浓度－时间曲线平缓，提示Hyp体内消除过程较缓。研究表明，Hyp口服生物利用度低［12］，其口服药动学特征及生物利用度低的可能原因需要进一步探讨。

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