甘草5种方法提取液主要药效学及急性毒性比较

2013-05-25程艳芹王英姿李明春中国人民解放军第40医院山东青岛6607北京中医药大学药学院北京000

中国医院药学杂志 2013年6期

程艳芹，王英姿，李明春（.中国人民解放军第40医院，山东青岛 6607；.北京中医药大学药学院，北京 000）

甘草是应用最为广泛的中药之一，素有“国老”之称，具有补脾益气，清热解毒，祛痰止咳，缓急止痛，调和诸药的功效［1］。我们前期对甘草用半仿生法（SBE）提取的工艺进行了优选［2］，为了考察SBE法对甘草的提取效果，对5种方法提取液［半仿生提取（SBE）、水提取（WE）、半仿生提取醇沉（SBAE）、水提醇沉（WAE）、醇提（AE）］作动物止咳、祛痰、抗炎、抗心律失常等药效学及小鼠最大耐受量的比较研究，从而进一步验证前期实验选出的提取工艺的科学性和合理性。

1 材料

1.1 仪器 721－100型分光光度计（上海第三分析仪器厂）；MA110型电子分析天平（上海第二分析仪器厂）；ECG－6511心电图机（上海光电医用仪器有限公司）。

1.2 药物与试剂甘草饮片购自安徽沪谯中药饮片厂，经山东中医药大学张兆旺教授鉴定，为豆科植物甘草Glycyrrhiza ralensis Fisch.的干燥根及根茎。25%氨水（批号010308，青岛化学试剂厂）；枸橼酸（批号990701，上海试剂一厂）；二甲苯（批号20031221，天津市广成化学试剂有限公司）。

1.3 实验动物昆明种小鼠，体质量（20±2）g，雌雄各半，由山东中医药大学实验动物中心提供（许可证号：SCXK（鲁）20050015）。Wistar大鼠，体质量（180～220）g，（200～250）g，雌雄各半，由山东中医药大学实验动物中心提供（许可证号：SCXK（鲁）20050015）。豚鼠，体质量200～250g，雌雄各半，由山东中医药大学实验动物中心提供（许可证号：SYXK（鲁）2005043）。

2 方法与结果

2.1 溶液的配制

2.1.1 SBE液称取甘草饮片，常压下用不同pH的水加热回流提取3次（加水量分别依次为饮片重量的10、6、6倍；浸泡30min），3煎提取pH 值分别为6.0、7.5、9.0，提取时间依次为2、1、1 h。分别滤过，离心（3000r·min－1，25 min），浓缩至0.1 g·mL－1（生药），即得。

2.1.2 WE液方法同“2.1.1”项下方法，仅将三煎用水换成纯化水。

2.1.3 SBAE液取“2.1.1”项下的SBE液，加入乙醇，使含醇量达40%，静置、冷藏，取上清液，回收乙醇，浓缩至0.1 g·mL－1，即得。

2.1.4 WAE 液取 “2.1.2”项下的 WE 液，按“2.1.3”项下方法依法制备，即得。

2.1.5 AE液方法同“2.1.1”项下，仅将提取溶媒改成50%的乙醇，回收乙醇，浓缩至0.1 g·mL－1，即得。

2.2 止咳作用［3，4］

2.2.1 小鼠浓氨水喷雾法取小鼠60只，体质量18～22 g，雌雄各半，随机均分成6组，即SBE、SBAE、WE、WAE、AE、纯化水组。灌胃给药（1.5 g·kg－1），对照组给等体积的纯化水。每天1次，连续6 d，末次灌胃1 h后，将小鼠逐个放入玻璃钟罩内，待其呼吸及活动正常后，通过空气压缩及连接玻璃喷头将25%浓氨水均匀地喷入钟罩内，喷雾5 s，动物继续于钟罩内滞留25 s后取出，放入倒置的大烧杯内，用秒表记录小鼠咳嗽潜伏期（开始喷雾后动物在烧杯内第1次咳嗽出现的时间）及5 min内咳嗽的次数，以此比较各组提取液的止咳效果。用SPSS 12.0统计软件作方差分析，比较组间均数，下同。

结果表明，5方法提取液均可使小鼠咳嗽潜伏期增加，咳嗽次数减少。咳嗽潜伏期，与纯化水组比较，SBE、WE、AE给药组有非常显著性差异（P＜0.01），SBAE、WAE有显著性差异（P＜0.05）；SBE与WE、SBAE以及 WAE比较有显著性差异（P＜0.05）。咳嗽次数，与纯化水组比较，SBE、AE给药组有非常显著性差异（P＜0.01），SBAE、WE、WAE有显著性差异（P＜0.05）；SBE与 WE、SBAE以及WAE比较有显著性差异（P＜0.05）。见表1。

2.2.2 豚鼠枸橼酸喷雾引咳法选用体质量200～250g豚鼠，雌雄各半，置容积为2 L的密闭玻璃钟罩内，喷入17.5%枸橼酸溶液1 min，将喷雾后5 min内咳嗽次数少于10次者剔除。取合格者48只，随机分为6组（同“2.2.1”项下），灌胃给药（1.2 g·kg－1），每天1次，连续5 d，末次给药后45 min将豚鼠置于玻璃钟罩内，同上法喷入17.5%枸橼酸溶液1 min，用秒表记录豚鼠咳嗽潜伏期（喷雾开始至第1次咳嗽出现的时间）及5 min内咳嗽的次数。

(4)尾煤泥二段回收。二段浓缩设备的底流进入压滤机，回收低热值细尾煤泥，滤液清净复用，并杜绝高灰粘土类矿物杂质恶性循环。

表1 5种方法提取液对小鼠咳嗽潜伏期（S）和5 min内咳嗽次数的影响（，n＝10）Tab 1 Effect of extracts picked up by the 5 methods on the latent period（S）and the frequency of cough of mice in 5 minutes（，n＝10）

注：与纯化水比较，aP＜0.05；bP＜0.01；与SBE组比较，cP＜0.05

内咳嗽次数纯化水 — 11.2±3.94 19.9±5.组别剂量／g·kg－1咳嗽潜伏期内咳嗽次数5 min51 SBE 1.5 26.5±6.52b9.2±4.78b WE 1.5 18.6±6.13bc14.6±4.48ac SBAE 1.5 17.3±4.44ac14.1±6.42ac WAE 1.5 16.6±4.16ac14.2±5.57ac AE 1.5 23.5±5.85b8.7±3.06b

结果表明，5组给药组与纯化水对照组比较，均可使豚鼠咳嗽潜伏期延长，咳嗽次数减少。咳嗽潜伏期，与纯化水组比较，SBE、AE给药组有极显著性差异（P＜0.01），WE、SBAE、WAE有显著性差异（P＜0.05）；SBE与SBAE比较有显著性差异（P＜0.05），与 WAE有极显著性差异（P＜0.01）。咳嗽次数，与纯化水组比较，SBE、WE、AE给药组有极显著性差异（P＜0.01），SBAE有显著性差异（P＜0.05），WAE无显著性差异（P＞0.05）；SBE 与SBAE比较有显著性差异（P＜0.05），与 WAE有极显著性差异（P＜0.01）。见表2。

表2 5种方法提取液对豚鼠咳嗽潜伏期（S）和5 min内咳嗽次数的影响（，n＝8）Tab 2 Effect of extracts picked up by the 5 methods on the latent period（S）and the frequency of cough of guinea pigs in5 minutes（，n＝8）

注：与纯化水比较，aP＜0.05；bP＜0.01；与SBE组比较，cP＜0.05；dP＜0.01

内咳嗽次数纯化水 — 60.6±11.54 17.1±7.组别剂量／g·kg－1咳嗽潜伏期内 5 min 02 SBE 1.2 136.2±41.61b6.6±3.11b WE 1.2 108.4±33.25a11.0±4.21b SBAE 1.2 92.3±26.45ac12.1±4.09ac WAE 1.2 94.1±24.53ad12.8±4.92d AE 1.2 135.9±27.18b7.5±1.93b

2.3 化痰作用［4，5］

2.3.1 小鼠气管段酚红法取小鼠60只，体质量22～26 g，雌雄各半，随机分为6组，分组及给药方案同“2.2.1”项下方法。末次灌胃30min后，腹腔注射酚红0.1 mL（0.5 mg·g－1），注射酚红30min后，处死动物，剥离气管周围组织，剪下自甲状软骨下至气管分支处气管段，放入盛有2 mL纯化水的试管中，再加入氢氧化钠（1 mol·L－1）2滴，用分光光度计于546 nm处测吸光度值（OD值），以OD值为酚红排泌量指标，以此评价5种提取液的祛痰结果。

结果表明，5种方法提取液均可使小鼠气管段酚红排泌量显著增加。与纯化水组比较，SBE、WE及AE有极显著性差异（P＜0.01），SBAE、WAE有显著性差异（P＜0.05）；SBE 与 WE、SBAE 及WAE比较有显著性差异（P＜0.05），与AE比较无显著性差异（P＞0.05）。见表3。

表3 5种方法提取液对小鼠气管酚红排泌量的影响（，n＝10）Tab 3 Effect of extracts picked up by the 5 methods on the amount of secreting phenol red in mice（，n＝10）

注：与纯化水比较，aP＜0.05；bP＜0.01；与 SBE组比较，cP＜0.05；dP＜0.01

组别剂量／g·kg－1OD值纯化水 — 0.042±0.01 SBE 1.5 0.084±0.021b WE 1.5 0.063±0.013bc SBAE 1.5 0.058±0.018ac WAE 1.5 0.057±0.014ac AE 1.5 0.070±0.013b

2.3.2 大鼠排痰量——毛细玻管法取大鼠60只，体质量200～250g，雌雄各半，随机分为6组（同“2.2.1”项下），给药组灌胃给药（1.2 g·kg－1），每天1次，连续5 d，末次给药后45 min，将动物用乌拉坦ip麻醉（1.0g·kg－1），仰卧固定，剪开颈部中皮肤，分离出气管，在甲状软骨下缘正中两软骨之间插入直径0.8 mm，长10cm毛细玻璃管，并开始计时，气管内分泌物沿毛细管上升，测定2 h内玻管内痰液柱长度（cm）。

结果表明，5种方法提取液均可使大鼠排痰量增加，与纯化水组比较，WAE有显著性差异（P＜0.05），其余4组给药组有极显著性差异（P＜0.01），5组给药组之间无显著性差异（P＞0.05），见表4。

表4 5种方法提取液对大鼠排痰量的影响（，n＝10）Tab 4 Effect of extracts picked up by the 5 methods on the amount of dispelling phlegm in rats（，n＝10）

注：与纯化水比较，aP＜0.05；bP＜0.01

cm纯化水 — 0.53±0.组别剂量／g·kg－1排痰量／19 SBE 1.2 1.08±0.32b WE 1.2 1.02±0.37b SBAE 1.2 0.94±0.34b WAE 1.2 0.83±0.29a AE 1.2 1.04±0.40b

2.4 对小鼠二甲苯性耳肿胀的影响［6－7］取小鼠60只，体质量18～22 g，随机分为6组（同“2.3.1”项下）。给药组分别灌胃（ig）给药2.0g·kg－1，连续给药4 d。末次给药后45 min，于小鼠右耳正反面均匀涂抹二甲苯30μL／只，30min后脱颈椎处死，用8 mm打孔器在左右耳相同部位打下耳片，分析天平称重。根据公式（1）、（2）分别计算肿胀度（mg）及肿胀抑制率（%）。

结果表明，5种方法提取液均可抑制二甲苯致小鼠耳肿胀，同纯化水组比较，SBE、AE有极显著性差异（P＜0.01），WE、SBAE、WAE有显著性差异（P＜0.05）；SBE与SBAE、WAE比较有显著性差异（P＜0.05）。AE的抑制率最高，其次是SBE，但二者比较无显著性差异（P＞0.05）。见表5。

表5 5种方法提取液对小鼠二甲苯性耳肿胀的影响（，n＝10）Tab 5 Effect of extracts picked up by the 5 methods on the mouse ear edema induced by xylene（，n＝10）

注：与纯化水比较，aP＜0.05；bP＜0.01；与SBE组比较，cP＜0.05

组别剂量／g·kg－1耳肿胀度／mg抑制率／%纯化水组 — 0.018±0.600059 SBE 2.00.0088±0.0028b50.48 WE 2.00.0112±0.0025a37.03 SBAE 2.00.013±0.0045ac26.39 WAE 2.00.013±0.0051ac27.96 AE 2.00.007±0.0041b51.

2.5 对氯化钡诱发大鼠心律失常持续时间的影响［8，9］取健康大鼠48只，体质量180～220g，随机分为6组（同“2.2.1”项下）。各给药组按1.2 g·kg－1灌胃给药，空白组灌胃同体积的纯化水，连用7 d。末次给药30min后，腹腔注射10%水合氯醛（300mg·kg－1）麻醉，麻醉后仰卧位固定于恒温手术台上，将金属针电极插入大鼠四肢末端皮下，并连接心电图机。先描记正常Ⅱ导联心电图（EGG）后，由舌下静脉注射0.4% 氯化钡2 mg·kg－1诱发心律失常，10s内注射完毕，记录心律失常持续时间。

结果表明，5种方法提取液均可使大鼠氯化钡所致心律失常时间缩短。与纯化水组比较，SBE及AE有极显著性差异（P＜0.01），WE、SBAE 及WAE有显著性差异（P＜0.05）。5组给药组之间无显著性差异（P＞0.05）。结果见表6。

表6 5种方法提取液对氯化钡诱发大鼠心律失常持续时间的影响（，n＝8）Tab 6 Effect of extracts picked up by the 5 methods on the duration of rat arrhythmia induced by BaCl2（，n＝8）

注：与纯化水比较，aP＜0.05；bP＜0.01

min纯化水组 — 126.86±17.组别剂量／g·kg－1持续时间／18 SBE 1.2 91.31±17.19b WE 1.2 97.75±10.14a SBAE 1.2 105.89±9.43a WAE 1.2 106.81±20.83a AE 1.2 94.92±18.64b

3 综合评判

将“2.2～2.5”项下各药理指标测定结果与该组纯化水的测定结果相除，得R值，再求各组R值的均值ˉR，以ˉR作为综合评判指标，大者为佳。结果ˉR值大小顺序分别为。见表7。

4 毒性比较－MTD的测定

取健康昆明种小鼠120只，雌雄各半，体质量18～22 g，按性别、体质量随机分为6组：SBE组、SBAE组、WE组、WAE组、AE组及对照组。按最大耐受量测定法，5种提取液的浓度均为1.5 g·mL－1。实验前12 h禁食不禁水，第2天分别于9：00、12：00、17：00时，按60mL·kg－1体质量灌胃给药3次，一日灌胃给药的最大给药量为90.0g（生药）·kg－1，本品成人临床拟用最大剂量为9 g（生药）·d－1，相当于成人（60kg）每天用药量（0.15 g·kg－1）的600倍。对照组灌胃等容量纯化水。给药后观察7 d，小鼠无一死亡，动物外观，行为活动，精神状态均正常，其毛发、饮食、粪便、活动、及生长情况均未见异常。7 d后处死动物，解剖后肉眼观察其心、肝、脾、肺、肾及胃肠道等主要器官，未见明显病理形态学变化。由此推算该药小鼠灌胃给药最大药量约为临床人日用量的600倍。因此认为本品各种方法提取液的毒性很小。

5 讨论

试验结果表明，甘草5种方法提取液中，SBE液在止咳、祛痰、抗炎、抗心律失常等方面的药理作用较SBAE及WAE显著性提高（P＜0.05）。各药理指标综合测定结果ˉR以SBE组最大，表明甘草以SBE法提取，提取物的综合药效最好。

用二甲苯作为致炎因子的炎症模型，是急性早期炎症的常用模型之一。从试验结果可以看出，5种方法提取液均对二甲苯所致耳肿胀急性炎症模型具有明显的抑制作用，且SBE、AE及WE组的作用比SBAE、WAE组更明显。表明醇沉减少了药效成分，从而影响药效。

氯化钡致大鼠心律失常动物模型为常用的心律失常动物模型，目前被广泛应用于中药药理学的研究之中。氯化钡能增加肌浦氏纤维Na＋内流，提高最大舒张期去极化速率，而诱发心律失常［10］。在本试验中发现，各组在舌下注射氯化钡后均立刻就有不同程度心律失常发生。因此，未做各组间的心律失常潜伏期的统计比较，只比较了各组间心律失常持续时间。

急性毒性试验中，尚未发现甘草5种提取液有毒性反应，表明其在临床应用常规剂量下是安全的。SBE、AE组的提取率虽高，但毒性与 WE、WAE、SBAE组无显著性差别。文献报道［11］，甘草长期使用，会导致水钠潴留，因此有必要做亚急性毒理试验或长毒试验。

［1］中国药典.一部［S］.2010：80－81.

［2］程艳芹，孙秀梅，张兆旺，等.均匀设计法优选甘草的半仿生提取工艺条件［J］.中药材，2007，30（5）：598－601.

［3］俞腾飞，田向东，李仁，等.甘草黄酮、甘草浸膏及甘草次酸的镇咳祛痰作用［J］.中成药，1993，15（3）：32－33.

［4］毕云，熊丽娟，王友立，等.必止咳胶囊主要药效学及急性毒性试验研究［J］.云南中医学院学报，2004，27（3）：22－25.

［5］邹冬良.咳安颗粒的药效学实验［J］.中国医院药学杂志，2007，27（3）：311－312.

［6］曲晓梅，金钟太，尚艳华，等.甘草水煎液抗炎作用的实验研究［J］.实用药物与临床，2005，8（5）：14－16.

［7］包淑云，喻丽珍，于禧龙.棉花根醇提物与水提物的止咳祛痰抗炎作用研究［J］.天然产物研究与开发，2011，23：730－733.

［8］何建成，刘雄，安耀荣，等.心肌康抗心律失常作用的研究［J］.中国中医药科技，2003，10（1）：40.

［9］李冀，赵伟国，李胜志，等.桂枝甘草汤及其提取物组分抗心律失常作用的实验研究［J］.中医药信息，2009，26（4）：41.

［10］陈奇.中药药理研究方法学［M］.北京：人民卫生出版社，1993：732－735.

［11］于辉，李春香，宫凌涛，等.甘草的药理作用概述［J］.现代生物医学进展，2006，6（4）：77－79.