10-羟基喜树碱治疗小鼠胶原诱导性关节炎

王 燕，魏永鸽，胡晓舟，胡慧华，邢华燕，张 燕，牛 琳，杜 柯

(1郑州大学第五附属医院，郑州450052;2郑州铁路职业技术学院)

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种以对称性多关节炎为特征的慢性全身性自身免疫性疾病。持续的滑膜炎可导致关节内软骨和骨的破坏，导致关节功能受限。目前虽然针对RA的治疗方法较多，如采用免疫抑制剂、激素、细胞因子拮抗剂、阻断T-B细胞接触的信号途径等［1～3］，但疗效并不理想，且不良反应大，因此，寻找疗效好、不良反应少的新型治疗药物一直是RA治疗领域的热门话题。10-羟基喜树碱(HCPT)不仅仅可以通过抑制细胞增殖而产生较强的抗肿瘤作用，同时还可以抑制淋巴细胞活性，减少机体异常的免疫反应，这提示HCPT理论上能控制RA疾病的发展。因此，本研究采用胶原诱导性关节炎(CIA)动物模型对HCPT的免疫调节作用进行了初步探讨。为了研究HCPT在CIA发病中的免疫调节机制，我们通过对CIA小鼠的干预实验、关节炎评分、CⅡ特异性T细胞增殖实验以及小鼠外周淋巴结T细胞亚群和细胞因子的检测来初步证实HCPT能否应用于RA的预防治疗，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 实验动物为6～8周的雄性DBA/1小鼠30只。主要试剂:鸡源性Ⅱ型胶原蛋白(CⅡ，纯度＞99%)购于Chondrex公司;Western blot实验抗体均购自 Cell Signaling公司;不完全弗氏佐剂(IFA)和热灭活结核分枝杆菌(TB)购于DIFCO公司;RPMI1640培养液、胎牛血清购于Gibco公司。HCPT:5 mL(10mg/支)。

1.2 方法

1.2.1 CIA模型的建立、分组及干预 将小鼠分为正常对照组、CIA阳性对照组、HCPT治疗组，每组10只。CIA阳性对照组和HCPT治疗组每只小鼠经尾根部2～3cm处皮下注射100 μL乳化抗原，并在第21天经小鼠背部两侧皮下注射CⅡ溶液和等量的IFA乳化后的抗原进行免疫加强。HCPT治疗组从第1天至第20天同时予HCPT 5mg/(kg·d)，腹腔注射，每日1次;正常对照组及CIA阳性对照组予相同剂量的生理盐水，每日1次。

1.2.2 关节炎评分 无异常变化为0分;踝关节有轻微的发红和肿胀，或个别足趾红或肿为1分;踝关节有中度红斑及肿胀为2分;爪子(包括足趾)出现严重的肿胀和红斑为3分;多关节的重度肿胀和关节畸形为4分。关节炎评分为每只小鼠四肢评分之和。

1.2.3 组织病理学分析 处死小鼠，分离膝关节、固定(10%甲醛)、石蜡包埋、切片，然后进行HE染色，并在显微镜下观察病灶炎性细胞浸润程度，分析各组小鼠的组织病理学进展。

1.2.4 HCPT干预后CⅡ特异性T细胞增殖能力检测 行CⅡ特异性T细胞增殖实验。取CIA小鼠脾脏制成单细胞悬液，调整细胞数为5×106/mL，分别加入0、5、10、20 μg/mL 的 CⅡ刺激，并于37 ℃、5%CO2培养箱培养48～56 h，然后每孔加入1 μCi的放射性同位素H3-TdR，继续培养至72 h，抽膜、洗板、加入闪烁液后读取Cpm(微居里)值。

1.2.5 小鼠外周淋巴结T细胞亚群检测 取发病高峰期小鼠的淋巴结制备成单细胞悬液，加入流式荧光抗体(购于BD、eBioscience公司)，通过胞内染色分别标记Th1、Th17细胞和Treg细胞，从而检测各细胞群的表达水平。

1.2.6 IFN-γ、IL-17、TGF-β 的检测 将各组小鼠脾脏制备成单细胞悬液(1×107/mL)，每组细胞悬液中加入20 μg/mL的CⅡ，并于37℃、5%CO2培养箱中培养48 h收集上清。用 ELISA方法检测，由eBioscience公司提供。

1.2.7 统计学方法 采用SPSS11.5统计软件。计量资料以±s表示，比较行t检验;计数资料比较采用χ2检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组关节炎评分和组织病理学观察结果HCPT治疗组关节炎评分明显低于CIA阳性对照组，尤其在患病高峰期，其评分远低于CIA阳性对照组。组织病理学分析示HCPT治疗组小鼠关节的炎性细胞浸润程度远小于CIA阳性对照组，且软骨的破坏亦不如CIA阳性对照组明显。在初次免疫后45～50 d左右，小鼠的病情均有所缓解，但HCPT治疗组小鼠的关节炎评分仍明显低于CIA阳性对照组，差异具有统计学意义(P＜0.05)，见图1。

图1 HCPT干预后关节炎评分

2.2 各组CⅡ特异性T细胞增殖能力检测结果HCPT处理后CⅡ特异性T细胞的增殖明显受抑(图2)，在 CⅡ 5、10 及20 μg/mL 时，HCPT 组 T 细胞增殖能力均明显低于CIA阳性对照组，P均＜0.05。正常对照组、CIA阳性对照组、HCPT治疗组的平均 CIA/HCPT比值分别为18.648±1.172/33.45±1.532、18.349±0.946/30.251±0.935、15.553±0.873/27.050±0.676。

2.3 各组小鼠外周淋巴结T细胞亚群及IFN-γ、IL-17、TGF-β的检测结果 正常对照组、CIA阳性对照组、HCPT治疗组炎症细胞Th1水平分别为0.813±0.073、1.808±0.075、1.055±0.103，Th17分别为1.561±0.112、5.712±0.269、3.806±0.375，Treg细胞百分比分别为78%、93%、74%，IFN-γ水平分别为830.4±31.479、2130.1±231.275、1630.0±128.949，IL-17水平分别为 80.0±8.124、170.1±12.087、170.1±12.087，TGF-β 水平分别为330.2±14.853、120.5±5.148、299.9±14.828，正常对照组与CIA阳性对照组及CIA阳性对照组与HCPT治疗组比较，P均＜0.05。

图2 HCPT对CⅡ特异性T细胞亚群增殖能力的影响

3 讨论

RA是一种常见的致畸性系统性自身免疫性疾病，全世界约有1%的人患有此病，而我国人群患病率0.24%～0.40%，各期RA患者超过500万人。该病临床表现多样，患者多在发病2年内即可出现不可逆的骨关节破坏，最后将导致关节强直、畸形和功能丧失。目前其病因和发病机制尚未阐明，据有关研究表明，RA发病与T淋巴细胞功能密切相关，而RA的治疗长期以来主要依靠免疫抑制剂如甲氨蝶吟、来氟米特、环孢素A及硫唑嘌呤等［4］，这些药物虽然在一定程度上可以控制RA的病情进展，但其毒副作用较大(如肝肾毒性及骨髓移植等)，因而在很大程度上限制了上述药物的临床使用。

近年研究发现，RA是一种具有增生性和破坏性的类似局部性恶性肿瘤的疾病，鉴于此特点，某些抑制肿瘤增殖的药物有望用于RA的治疗。HCPT可通过抑制细胞增殖而产生较强的抗肿瘤作用，同时还可以通过抑制淋巴细胞的活性，进而抑制机体的异常免疫反应，因此，在理论上HCPT能够起到控制RA疾病发展的作用，我们的前期工作亦证实了这种推测。所以HCPT有望成为治疗RA的新型药物。但目前尚无关于HCPT如何抑制RA滑膜炎症的报道，我们在CIA模型中对上述机制进行了初步探讨。

CIA模型是一种免疫炎症模型，其特征是多发性关节炎，发病机制和病理特征与人类RA相似，该模型的一个显著的特点是T淋巴细胞、B淋巴细胞对CII均有过度应答［5］。本研究结果显示，HCPT不仅可以明显推迟CIA小鼠的发病，而且在发病过程中，HCPT治疗组小鼠的关节炎评分明显降低，小鼠关节切片中，炎症细胞浸润的程度亦明显降低，软骨破坏程度明显减轻。从增殖实验分析，HCPT治疗组小鼠CⅡ特异性T细胞对CⅡ的反应明显下降。上述结果提示HCPT可抑制CⅡ特异性T细胞的反应能力。

另外我们还发现，在CIA发病初期，滑膜中就可以分离出Th1及Th17细胞，提示这些细胞可能是介导炎症发生的关键，并且和炎症的严重程度有关［6～9］。IL-10 和 TGF-β 主要来源于 Treg 细胞，在RA关节的滑膜中，Treg细胞生成明显减少［10］。研究发现，RA外周血中Treg虽然可以抑制炎性细胞增殖，但未抑制IFN-γ及IL-17的产生。通过检测不同组小鼠体内Th亚群的变化发现，HCPT治疗组小鼠体内Treg细胞在CD+4T细胞中的百分比明显增高，在体外其分泌细胞因子TGF-β的能力显著增强，而Th1、Th17细胞在HCPT治疗组中的表达下降，分泌炎症因子的能力被抑制。以上结果均表明，HCPT预先干预CIA小鼠可诱导小鼠产生免疫抑制效应，进而降低免疫系统对CII抗原的敏感性，从而抑制疾病的发生发展。

综上所述，HCPT治疗小鼠CIA效果较好，其可通过抑制自身反应性T细胞增殖，上调体内Treg细胞并抑制Th1、Th17细胞的表达而发挥免疫调节作用，有效降低CIA小鼠发病严重程度，改善关节炎症。本研究为HCPT治疗自身免疫性疾病提供了新的理论依据。

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