响应曲面法优化黄参茎叶多酚的提取工艺及其抗氧化活性

马婷婷， 田呈瑞， 李龙柱， 权美平， 张 娟， 赵 珮， 张颖娜

（陕西师范大学 食品工程与营养科学学院，陕西 西安 710062）

黄参在植物分类学上属伞形科迷果芹属植物迷果芹（Sphallerocarpus gracilis），多年生草本，主要分布在内蒙古、黑龙江、甘肃、青海、和西藏等高寒地区，俗称黄葑、小叶山红萝卜，其根肉质，呈淡黄色，可食，富含蛋白质和各种矿质元素，灾年群众用其救饥荒，普通年份也用其烹饪成各种佳肴美食[1-2]。整个植株亦可用药，是一种极具开发前景的药食两用的植物。据《本草纲目》记载，黄参味甘、性温，有补气养血、滋阴壮阳、通经活络、舒肝健胃的功效，对中老年人胃气虚寒、神疲乏力，妇女气血失调，儿童发育迟缓、营养不良、挑食厌食效果俱佳，被誉为“小人参”。另据《晶珠本草》记载，黄参治黄水病，腰肾寒症。因此，黄参是一种营养丰富、药用价值极高的纯天然绿色保健食品，具有广泛的应用与开发前景。黄参在我国分布广泛，资源丰富，然而，目前有关黄参的研究、开发较少，仅有的文献报道也只局限于黄参根部、籽中的化学成分、微量元素的分析及功效作用[3-6]，而据我们所知，有关黄参茎叶的研究国内外尚未报道。作者以黄参茎叶为原料，采用超声波辅助提取多酚，通过响应曲面法优化提取工艺条件，并采用3种方法分析黄参茎叶多酚的抗氧化活性，以期为黄参茎叶的开发利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

黄参茎叶：于2012年7月采自甘肃山丹军马场，采第二年茎叶；没食子酸标准品、碳酸钠、福林酚试剂，无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、三氯化铁、三氯乙酸、氯仿、铁氰化钾、二氯化亚铁、水杨酸、双氧水等：均为分析纯，西安化学试剂厂生产；LAC164型电子分析天平；恒温水浴锅；KQ-200KDE型超声波清洗器；RE-52旋转式蒸发器：上海安亭；722型可见分光光度计：上海光谱；FW100型高速万能植物粉碎机；GZX-9146MBE数显鼓风干燥箱：上海迅博。

1.2 试验方法

1.2.1 样品处理 黄参茎叶→摊凉→去除杂物→洗净→晒至半干→烘箱内50℃烘干→植物粉碎机粉碎→过60目筛→密封保存备用。

1.2.2 标准曲线的建立

1）没食子酸标准溶液的配置：精确称取没食子酸标准品0.010 0 g，置于100 mL容量瓶中，用蒸馏水溶解，稀释至刻度，摇匀，即得质量浓度为100 μg/mL的没食子酸标准溶液。

2）没食子酸标准曲线的建立[7]：精确吸取标准溶液 0.0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL， 分别置于 7个10 mL试管中，加入1.5 mL福林酚试剂，2.5 mL 7.5%的碳酸钠溶液，并用蒸馏水定容，摇匀，暗室反应60 min，于765 nm波长下测定吸光值，每个质量浓度做3个平行实验，取平均值并绘制标准曲线，吸光度值Y与没食子酸标准溶液质量浓度X（μg/mL）之间的回归关系为：Y=0.115 1X+0.006 7，R2=0.998 5。

1.2.3 样品总酚质量浓度的测定 准确称取1.000 g样品粉，按一定体积分数的乙醇和一定的料液比、超声时间、超声温度进行超声提取后，3 500 r/min离心30 min，取上清液按1.2.2的方法测定其在 765 nm处的吸光度，并计算多酚得率（%）。

式中，Y为多酚得率（%）；c为由标准曲线计算得出的样品液的总酚质量浓度 （μg/mL）；V为样品液的体积（mL）；m 为样品粉质量（g）；D 为稀释倍数。

1.2.4 响应曲面法（RSM）优化设计

1）溶剂选择：采用水、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯作为提取溶剂，观察提取效果，以选择合适溶剂。

2）单因素实验：在超声功率和超声频率分别为200 W和80 Hz的条件下研究乙醇体积分数、超声温度、料液比、超声时间对总酚得率的影响，以料液比 1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45 g/mL； 提取温度40、50、60、70、80、90 ℃ 和超声时间 10、20、30、40、50、60 min作为考察因素，以多酚得率作为实验指标，进行单因素实验，考察各因素对提取效果的影响[8]。

3）响应曲面法优化：在单因素实验的基础上，根据Box-Behnken中心组合设计原理，作者以乙醇体积分数（%）、超声温度（℃）、以及料液比（g/mL）为主要的考察因子 （自变量）， 分别以X1、X2、X3表示，以黄参茎叶得率Y为响应值，利用Design-ExpertV.8.0.5b软件设计了3因素3水平的响应曲面法实验，共有17个实验点，其中12个为析因点，5个为零点以估计误差，实验因素水平编码值见表1。

表1 中心组合实验Box-Behnken设计因素和水平编码值Table 1 Independent variables and levels in Box-Behnken CCD

1.2.5 抗氧化活性的测定

1）清除DPPH自由基能力的测定：参照Brandwilliams等[9]的方法，稍作修改测定黄参茎叶多酚粗提取对DPPH自由基的清除能力。实验测定前，配制0.1 mmol/L的DPPH乙醇溶液。精确吸取2.0 mL的不同浓度多酚样品水溶液和6.0 mL新配制的DPPH溶液于试管中，均匀混合，避光反应30 min，于517 nm处测定其吸光度，记录数据。空白对照用等体积的蒸馏水代替多酚样品液测定乙醇溶液中未反应之前DPPH的吸光度。用与样品溶液同浓度的抗坏血酸溶液和BHT溶液作为阳性对照。以样品液浓度为横坐标，自由基清除率为纵坐标作图分析样品清除自由基的能力。每次实验重复三次。对DPPH自由基的清处能力按公式（2）计算：

式中，I表示对自由基的清除率（%）；Ai表示样品溶液和DPPH溶液混合液的吸光度（2 mL样品溶液+6 mL的DPPH溶液）；Aj表示未加 DPPH溶液的样品溶液的吸光度（2 mL样品溶液+6 mL的乙醇溶液）；A0表示未加样品时 DPPH溶液的吸光度 （2 mL乙醇溶液+6 mL的DPPH溶液）。

2）还原力的测定：样品提取液还原力的测定依照稍作修改的Vaquero等[10]的方法进行。取2.5 mL的样品提取液（样品质量浓度的变化范围是0.1~1.0 mg/mL）加入到装有2.5 mL 0.2 mol/L pH 6.6的磷酸缓冲液的试管中，再加入2.5 mL 1%的铁氰化钾溶液混合均匀。50℃反应20 min后，加入2.5 mL 10%的三氯乙酸在3 000 r/min的转速下离心10 min，取上清液5 mL与4 mL的蒸馏水和0.5 mL 0.1%的三氯化铁溶液混合。反应10 min后，在700 nm处测其吸光度。混合液的吸光度越高表示样品提取液的还原能力越强。

3）清除羟基自由基能力的测定：按照Yan等[11]描述的方法测定样品提取液对羟基自由基的清楚能力。将2 mL的样品溶液与2 mL、2 mmol/L的二氯化铁、2 mL、2 mmol/L的过氧化氢溶液和2 mL、6 mmol/L的水杨酸混合，再加入10 mL的蒸馏水，在37℃的水浴锅中反应30 min。在510 nm处设置空白对照测定其吸光值。阳性对照为抗坏血酸和BHT。以样品质量浓度为横坐标，清除率为纵坐标作图分析对羟基自由基的清除能力。每次实验重复三次。 清除率（SA）按公式（3）计算：

式中，A0表示未加样品混合液的吸光度（2 mL的二氯化铁+2 mL过氧化氢+2 mL水杨酸）；Ai表示样品的吸光度 （2 mL的二氯化铁+2 mL过氧化氢+2 mL水杨酸+2 mL的样品溶液）；Aj未加过氧化氢溶液样品的吸光度（2mL的二氯化铁+2mL水杨酸+2mL的样品溶液）；SA为样品对羟基自由基的清除率（%）。

2 结果与分析

2.1 提取溶剂对多酚得率的影响

精确称取黄参茎叶粉末 0.2 g，按 1∶30的料液比分别加入水、60%的乙醇、60%的甲醇、60%的丙酮、60%的乙酸乙酯 ，60℃下超声提取30 min，提取2次后合并，并于3 500 r/min离心30 min，取上清液，测定其多酚含量。比较5种溶剂的提取效果，从中选择最佳溶剂。每次实验重复3次，取平均值。不同溶剂提取效果见图1。可知提取得率分别是丙酮＞乙醇＞乙酸乙酯＞甲醇＞水，但由于丙酮有毒，基于得率和安全性的双重考虑，我们选用提取得率第二的乙醇进行后续试验。

图1 提取溶剂对多酚得率的影响Fig.1 Influence of the kind of solvent on yield of polyphenol

2.2 超声波辅助提取单因素实验

2.2.1 乙醇体积分数对多酚得率的影响 按料液比 1∶30，超声温度 60℃，超声时间 30 min，研究不同浓度的乙醇对多酚得率的影响，其他步骤参照2.1.1。由图2可知，随乙醇体积分数的增加，多酚得率不断增大，当乙醇体积分数为70%时，黄参茎叶多酚的提取率最大，当乙醇体积分数大于70%时，多酚得率急剧下降；当乙醇体积分数为90%时，多酚类的溶出明显受到抑制，最佳乙醇体积分数为70%。

图2 乙醇体积分数对多酚得率的影响Fig.2 Influence of ethanol concentration on yield of polyphenol

2.2.2 超声温度对多酚得率的影响 按料液比1∶30，乙醇体积分数70%，超声时间30 min，研究不同超声温度对多酚得率的影响，其他步骤参照2.1.1，结果见图3。多酚得率随着超声温度的升高而增大，当温度为 70℃ 时，多酚得率达到最高，大于 70℃时，因温度过高导致一部分溶剂挥发损失并且对多酚成分造成一定程度的破坏，所以提取率反而降低。因此提取温度选择70℃为最佳。

图3 超声温度对多酚得率的影响Fig.3 Influence of ultrasonic temperature on yield of polyphenol

2.2.3 超声时间对多酚得率的影响 按料液比1∶30，乙醇体积分数70%，超声温度70℃，研究不同超声时间对多酚得率的影响，其他步骤参照2.1.1，结果见图4。随着超声时间的延长，多酚得率不断提高，尤其是在30 min时，得率的提高幅度较大，在30～50 min得率呈现缓慢下降趋势，而在60 min时，得率明显下降，可能是由于超声作用时间过长，有效成分发生降解或氧化遭到破坏从而导致得率的降低。因此最佳超声时间为30 min。

图4 超声时间对多酚得率的影响Fig.4 Influence of ultrasonic time on yield of polyphenol

2.2.4 料液比对多酚得率的影响 按乙醇体积分数70%，超声温度70℃，超声时间30 min，研究不同料液比对多酚得率的影响，其他步骤参照2.1.1，结果见图5。增加液料比可提高乙醇提取的效果，并且在料液比1∶35之前，多酚得率提高较快，之后便趋于平缓。料液比在1∶35时得率最大，但从提取成本考虑因此选择料液比1∶35。

图5 料液比对多酚得率的影响Fig.5 Influence of solid-to-solvent ratio on yield of polyphenol

2.3 响应曲面法优化黄参茎叶多酚提取工艺

2.3.1 响应曲面实验设计与结果 根据Box-Behnken试验设计原理，综合单因素影响试验结果，选取乙醇体积分数、超声温度、料液比3个对多酚提取影响显著的因素，在单因素试验基础上采用三因素三水平的响应面分析法。单因素试验结果显示：以乙醇为提取溶剂，乙醇体积分数70%、超声温度70℃、料液比为1∶35时，黄参茎叶多酚有最大提取率。超声波辅助提取黄参茎叶多酚的响应曲面实验结果与分析见表2。

表2 Box-Behnken设计方案及黄参茎叶多酚得率的测定结果Table 2 Box-Behnken CCD matrix and resonses values of polyphenol

应用Design expert.V.8.0.5b软件，结合表2实验数据，进行回归拟合，得到得率对乙醇体积分数、超声温度、料液比的二次多项式回归方程：

式中，Y 为黄参茎叶多酚的预测值，x1、x2、x3分别为上述3个自变量的编码值，该模型的方差分析结果见表3，模型系数显著性检验见表4。

表3 模型方差分析Table 3 Variance for regression equation

从表3可知，本实验选用的模型极显著 （p＜0.01），失拟项不显著（p=0.083 1＞0.05），说明模型是合适的，模型的校正决定系数R2Adj=0.940 4，说明该模型可以解释94.04%的响应值变化，相关系数R=0.986 8，说明该模型拟合程度良好，实验误差小，该模型是合适的，可以用此模型对黄参茎叶多酚的提取工艺进行分析和预测。

从表4的回归方程系数显著性检验可知，方程的二次项的影响均极显著，交互影响显著，各一次项显著性参差不齐，表明各影响因素对多酚得率的影响不是简单的线性关系，所以可以利用回归方程来确定最佳提取工艺条件。依据参数估计值可判断影响因子的主效应主次顺序为：乙醇体积分数＞超声温度＞料液比。

2.3.2 响应曲面分析 根据回归方程式（4），作响应曲面图，考察所拟合的响应曲面的形状，分析乙醇体积分数、超声温度和料液比对多酚得率的影响。其响应曲面及其等高线见图6～8。图6显示，当料液比为最佳值（x3=1∶35）时，乙醇体积分数和超声温度对多酚得率的交互作用。图7显示，当乙醇体积分数为最佳值（x1=70%）时，超声温度和料液比对多酚得率的交互作用。图8显示，当超声温度为最佳值（x2=70℃）时，乙醇体积分数和料液比对多酚得率的交互作用，三组图直观地反映了各因素对响应值的影响，对应的等高图直观地反映出各因素交互作用对响应值的影响，圆形表示二因素交互作用不显著，椭圆形表示二因素交互作用显著[11]。

表4 模型各系数显著性检验结果Table 4 Test of significance for regression coefficients

2.3.3 最佳工艺参数及验证试验 通过design expert8.0优化的工艺条件为提取黄参茎叶多酚的工艺优化条件为：乙醇体积分数74.25%，超声温度70.30℃，料液比1∶34.57，此时多酚的理论得率为1.145 2%。为检验响应曲面法优化结果的可靠性，采用上述优化条件提取黄参茎叶多酚，考虑实际操作的便利性，将条件优化为：乙醇体积分数75%，超声温度70℃，料液比1∶35，在此条件下做3次重复试验得到相对标准偏差进行验证，结果见表5。平均得率达到了1.1448%，和理论预测值相比，其相对误差小于1%，因此，基于响应曲面法所得的黄参茎叶多酚优化提取工艺参数准确可靠，具有实用价值。

图6 乙醇体积分数（x1）、超声温度（x2）及其相互作用对多酚得率影响的响应面和等高线Fig.6 Response surface plot and its contour plot of the effect of ethanol concentration （x1）and ultrasonic temperature （x2）and theirs mutual interactions on yield of polyphenol

表5 验证试验结果Table 5 Results of experimental verifications

图7 超声温度（x2）、料液比（x3）及其相互作用对多酚得率影响的响应面和等高线Fig.7 Response surface plot and its contour plot of the effect of ultrasonic temperature（x2）and solid-tosolvent ratio （x3）and theirs mutual interactions on yield of polyphenol

图8 乙醇体积分数（x1）、料液比（x3）及其相互作用对多酚得率影响的响应面和等高线Fig.8 Response surface plot and its contour plot of the effect of ethanol concentration （x1）and solid-tosolvent ratio （x3）and theirs mutual interactions on yield of polyphenol

2.4 黄参茎叶多酚的抗氧化能力

2.4.1 清除DPPH自由基的能力 图9为不同质量浓度的黄参茎叶多酚提取物和阳性对照清除DPPH自由基的能力。从图9可知，随着多酚提取物质量浓度的增加（由0.1~1.0 mg/mL），DPPH自由基的清除率由33.01%增加到83.88%。与同质量浓度的抗坏血酸和BHT相比较，样品的清除率在低质量浓度时稍微高于BHT，高质量浓度时和BHT相当，但低于抗坏血酸的清除率。在实验质量浓度范围内，抗坏血酸对DPPH自由基的清除率在92.4%~98.1%范围内。

图9 黄参茎叶多酚、BHT和抗坏血酸对DPPH自由基的清除效果Fig.9 Scavenging effect of Sphallerocarpus gracilis stem leaves polyphenol，BHT and VC on DPPH radical

2.4.2 清除羟基自由基的测定 由图10不同质量浓度的黄参茎叶多酚和阳性对照对羟基自由基的清除效果可知，当多酚质量浓度由0.1 mg/mL增加至1.0 mg/mL时，其对羟基自由基的清除率由22.95%上升到44.79%，且低质量浓度时样品对羟基自由基的清除率略低于BHT，高浓度时和BHT基本持平，但抗坏血酸对羟基自由基的清除率明显高于样品和BHT。从图10还可看出，随着质量浓度的增加，样品和BHT对羟基自由基的清除能力并没有呈现明显的量效关系。

图10 黄参茎叶多酚、BHT和抗坏血酸对羟基自由基的清除效果Fig.10 Scavenging effect Sphallerocarpus gracilis stem leaves polyphenol，BHT and VC on hydroxyl free radical

2.4.3 提取物的还原能力 黄参茎叶多酚、抗坏血酸和BHT的还原能力见图11。可以看到，随着多酚质量浓度的增加，其还原力也随之增加。在实验质量浓度范围内，还原力与质量浓度呈现一定的量效关系，同等质量浓度条件下，还原能力的大小顺序为VC＞BHT＞黄参茎叶多酚。还原能力的测定中，多酚类化合物的存在使得铁氰化物中的三价铁变成以Fe2+存在的复杂化合物。根据文献[13-15]的研究报道，测定多酚类物质的还原能力对解释说明它们的抗氧化效果和还原能力之间的关系是必要的。多酚类化合物是良好的电子供体，能够通过使自由基转化成更稳定的产物而使终止自由基反应链。

3 结语

根据单因素试验和响应曲面法得到黄参茎叶多酚的最佳提取工艺条件为：乙醇体积分数74.25%、提取温度 70.30 ℃、料液比（g/mL）34.57、超声时间为30 min，此时黄参茎叶多酚的提取得率是1.1448%，和理论预测值相比，其相对误差小于1%，因此采用响应曲面法对黄参茎叶多酚超声波辅助提取条件进行优化可行。依据参数估计值可判断影响因子的主效应主次顺序为：乙醇体积分数＞超声温度＞料液比。

图11 黄参茎叶多酚、BHT和抗坏血酸的还原能力Fig.11 Reducing power of Sphallerocarpus gracilis stem leaves polyphenol，BHT and VC

体外抗氧化试验研究表明：黄参茎叶多酚具有一定的还原力和清除羟基自由基的能力，并且对DPPH自由基有较强的清除效果，黄参茎叶多酚具有较强的抗氧化活性，可以开发为一种高效、天然的抗氧化剂。

本研究结果表明：黄参的茎叶多酚具有较强的抗氧化活性，这不仅为黄参茎叶的研究提取了基础的理论数据，而且还为黄参的进一步开发利用提供了参考依据。黄参作为一种药食两用的植物，若能在保健功效和药用价值等方面进行开发，其应用前景将更加广阔。开发黄参茎叶资源，变资源优势为经济优势，推动地方经济的发展，使黄参这种药食两用的资源产生更大的经济效益与社会效益。

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