利用AutoMate ExpressTM自动化法医DNA提取系统提取骨骼及牙齿DNA
2013-05-19高林林徐念来丁少成王东京马丽琴李佑英
高林林，徐念来，谢 炜，丁少成，王东京，马丽琴 ，李佑英
骨骼及牙齿DNA的提取方法有CTAB法[1]、硅珠法[2]、压力循环仪法[3]，但这些方法有的需要长时间脱钙、有的需要有机纯化等，增加了骨骼及牙齿DNA的提取难度，同时也增加了样品污染的概率。本研究采用AutoMate ExpressTM自动化法医DNA提取系统对骨骼及牙齿的DNA提取进行探索，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 材料
选取骨骼33份，牙齿15份（每份2枚），均来自于日常检案中的不同个体。
1.2 主要仪器及试剂
1.2.1 仪器
AutoMate ExpressTM自动化法医DNA提取系统、7500定量PCR仪、9700扩增仪、3130XL遗传分析仪（美国AB公司），6770冷冻研磨机（美国SPEX SamplePrep公司），电钻，牙齿粉碎器（公安部物证鉴定中心）。
1.2.2 试剂
PrepFiler Express BTATM法医DNA提取试剂盒、Quantifiler DNA定量试剂盒、Identifiler®Plus试剂盒（美国AB公司）。
1.3 方法
1.3.1 样本处理
33份骨骼用刀将骨骼内、外表面均刮干净，清洗后晾干，在紫外灯下照射2h。在骨密质部位取一小块骨片用冷冻研磨机研磨成骨粉。此外，随机选取其中10份已清洗好的骨骼用电钻在骨密质部位钻取制成骨屑（手工处理）。
15份牙齿（每份2枚）用刀片将表面刮干净，75%乙醇溶液及去离子水分别浸泡牙齿10min，在紫外灯下照射2h。取其中一枚牙齿用冷冻研磨机研磨成牙粉。此外，随机选取其中10份已清洗好的另一枚牙齿用牙齿粉碎器砸成粉末（手工处理）。
1.3.2 样本量与消化时间的最优化
随机选取用冷冻研磨机研磨的骨粉及牙粉样本共10份（骨粉6份，牙粉4份），根据不同的样本量（50、100、150mg）及消化时间（2、18h）将每份样本分成6组。根据所得DNA含量选择最佳样本量及消化时间。
1.3.3 AutoMate ExpressTM自动化法医DNA提取系统提取方法
取骨粉或牙粉置于管中，加入PrepFiler Express BTATM法医DNA提取试剂盒中提供的裂解缓冲液300μL、蛋白酶 K 15μL及 DTT 15μL，在 56℃恒温混匀仪上以离心半径5 cm，1 100 r/min，消化2 h（或18h）后，依照PrepFiler Express BTATM法医提取DNA试剂盒操作说明书在AutoMate ExpressTM自动化法医DNA提取系统选择BTA程序提取DNA，DNA模板终体系为50μL。
1.3.4 PCR扩增及产物检测
采用Identifiler®Plus试剂盒在9700扩增仪上进行扩增。扩增体系为10μL，其中反应液4μL，引物2μL，DNA 4μL。扩增条件为 95℃ 11min；94℃ 20s，59℃ 3min，59℃ 3min，30 个循环；60℃ 30min。 PCR产物用3130XL遗传分析仪电泳检测，GeneMapper ID-X软件对结果进行分型。
2 结 果
2.1 不同样本量不同消化时间下所得DNA质量浓度的比较
表1显示，消化时间对DNA质量浓度的影响差异无统计学意义（P＞0.05），而样本量为50mg的检材得到的DNA质量浓度明显低于样本量为100 mg与150 mg的检材（P＜0.05）。虽然样本量为100 mg与150mg的检材得到的DNA质量浓度差异无统计学意义（P＞0.05），但从STR分型效果来看，样本量为150mg的检材其RFU值及峰值均衡性均优于样本量为100mg的检材。经过对样本量及消化时间的综合比较，本方法采用样本量为150mg及消化时间为2h来提取所有的骨骼及牙齿样本。
表1 不同样本量及不同消化时间得到的DNA质量浓度比较（n=10，±s，ng/μL）
表1 不同样本量及不同消化时间得到的DNA质量浓度比较（n=10，±s，ng/μL）
注：1）与 50mg样本量相比，P＜0.05
消化时间 50mg 100mg 150mg 2h 0.0203±0.0183 0.0405±0.02781） 0.0407±0.03221）18h 0.0252±0.0203 0.0459±0.02981） 0.0662±0.04651）
2.2 冷冻研磨机研磨样本的DNA质量浓度及STR分型结果
经冷冻研磨机研磨的33份骨骼及15份牙齿样本采用AutoMate ExpressTM自动化法医DNA提取系统提取的DNA质量浓度及STR分型结果见表2。33份骨骼中有2份比较新鲜的样本得到的DNA质量浓度很高（分别为 21.93、26.20 ng/μL），15 份牙齿样本中也有2份比较新鲜的磨牙得到的DNA质量浓度非常高（分别为 10.18、30.98ng/μL）。 其余的样本中，牙齿样本得到的DNA质量浓度普遍比骨骼样本的高。骨骼及牙齿样本均获得了较好的STR分型结果（图1～2）。
表2 骨骼及牙齿样本DNA质量浓度及STR分型结果
图1 牙齿样本的STR分型
图2 骨骼样本的STR分型
2.3 冷冻研磨处理样本与手工处理样本所得DNA质量浓度的比较
取冷冻研磨法和手工处理法处理后的各10份骨骼及牙齿样本，均采用AutoMate ExpressTM自动化法医DNA提取系统提取DNA，所得DNA平均质量浓度见表3。骨骼样本采用液氮冷冻研磨处理提取得到的DNA平均质量浓度与手工处理相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。牙齿样本采用液氮冷冻研磨处理所得DNA平均质量浓度高于手工处理组（P＜0.05）。
表3 两种方法处理样本的DNA质量浓度比较（n=5，±s，ng/μL）
表3 两种方法处理样本的DNA质量浓度比较（n=5，±s，ng/μL）
注：1）与手工处理法相比，P＜0.05
样本 手工 液氮冷冻研磨骨骼 0.0400±0.0250 0.0600±0.0510牙齿 0.6125±1.2215 0.8118±1.36771）
2.4 案例应用
本实验室曾在2008年12月对1例清代遗骸（约150年以上）进行DNA检验，Y-STR分型与后代完全一致[4]。而常染色体则只在9个小片段基因座获得了STR分型，其RFU值最高只有160。2012年对保存3年多的该骨骼骨粉采用本研究建立的方法进行重新检验，使用Identifiler®Plus试剂盒进行扩增，获得13个基因座的STR分型，只有3个大片段基因座未检出，其RFU值也上升到500左右。通过Minifiler试剂盒扩增后将16个基因座全部补充完整（图3～4）。
图3 2012年自动化提取获得的STR分型
图4 Minifiler试剂盒扩增获得的STR分型
3 讨 论
骨骼及牙齿中DNA含量低，又有坚硬的细胞外基质保护，使得此类检材的检验难度较大。检验步骤复杂繁琐、易污染、检出成功率低、取材量大、耗时长等问题一直以来都无法得到有效解决。
本研究采用AutoMate ExpressTM自动化法医DNA提取系统及PrepFiler Express BTATM法医DNA提取试剂盒相结合的方法实现了骨骼及牙齿高效、快捷的自动化DNA提取。其成功率（骨骼93.9%、牙齿93.3%）与文献[2]报道的磁珠法提取成功率（骨骼95.5%）相近。本研究方法具有以下几个明显优势：（1）取材量极少，仅需150mg，是手工提取所需样本量的1/10～1/8，有效解决了部分传统磁珠法提取无法复核的困境；（2）DNA 质量高，PrepFiler Express BTATM法医 DNA提取试剂盒中提供的特殊构造的纳米级磁珠使得单位体积内的磁珠可以有更大的表面积来吸附DNA，且其所获得的DNA纯度也极高[5]；（3）提取时间短，该方法提取骨骼及牙齿DNA仅需要56℃消化2h及自动化提取DNA 30min即可完成；（4）免脱钙，该方法不需EDTA脱钙，将繁琐、反复、长时间的脱钙步骤取消，不仅大大缩短了提取时间，也使该类检材的污染机会大大降低；（5）实现自动化，与常量及脱落细胞类生物检材一样可以在同一平台进行DNA提取。此外，全封闭式操作环境为防污染又提供了一道保护网。
骨骼类样本使用冷冻处理与手工处理所获得的DNA质量浓度差异无统计学意义，工作中可结合实际选择处理方法。牙齿类样本使用冷冻研磨处理获得的DNA质量浓度高于手工处理样本，可能与液氮冷冻研磨获得的牙粉中有核细胞暴露更多有关。
因此，在具备AutoMate ExpressTM自动化法医DNA提取系统的DNA实验室，没有配备液氮冷冻研磨机的情况下仍可进行骨骼及牙齿样本DNA的自动化提取。但在配备有液氮冷冻研磨机的DNA实验室可优先选取牙齿样本，因为牙齿样本的前处理简便，而且得到的DNA质量浓度也比骨骼样本高，更容易成功检验。
[1]叶健，季安全，郑秀芬，等.陈旧性骨骼DNA提取技术的研究[J].中国法医学杂志，2001，16（S0）：8-11.
[2]贾东涛，韩海军，张玉红，等.陈旧骨骼DNA提取方法的应用研究[J].中国法医学杂志，2007，22（4）：260-261.
[3]苑美青，凃政，李彩霞，等.利用压力循环仪提取骨骼DNA[J].刑事技术，2011，（4）：29-32.
[4]李佑英，高林林，朱琳，等.清代遗骸Y-STR检验1例[J].中国法医学杂志，2011，26（2）：132-133.
[5]Davis GP，King JL，Budowle B，et al.Extraction platform evaluations： A comparison of Automate ExpressTM，EZ1®Advanced XL，and Maxwell®16 Bench-top DNA extraction systems[J].Legal Medicine，2012，14（1）：36-39.
