偏执型精神分裂症患者GRIN1基因-855 G/C与-1140 G/A位点的遗传多态性

李忠杰 ，丁 梅 ，庞 灏 ，孙雪菲 ，邢佳鑫 ，宣金锋 ，王保捷

（1.中国医科大学法医学院，辽宁 沈阳 110001；2.张家港市公安局，江苏 张家港 215600）

谷氨酸（Glu）为哺乳动物体内重要的兴奋性神经递质，参与神经系统多种重要功能的调节，谷氨酸对于学习、记忆及神经传导等有着重要的作用，其传导通路发生异常时，可能会引发精神疾病[1]。精神分裂症（schizophrenia，SP）为一组病因不明的疾病，临床表现以思维过程松散、不合逻辑的联想、荒谬的妄想、情感不恰当或平淡和社会功能缺损为主要症状[2]。精神分裂症是法医学鉴定的重要内容之一，除一定的环境因素影响外，其发病的遗传学因素也得到了明确的证实，许多神经递质与精神分裂症的关系已有报道，可能为精神分裂症的诊断或法医学鉴定提供客观的参考指标。

鉴于已知的GRIN1基因（谷氨酸受体基因之一）启动子区域单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）位点在中国人群中数据较少，国际上已有GRIN1基因SNP位点与精神分裂症的关联研究[3-4]，本研究应用PCR限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）技术结合PAGE法，分析中国北方汉族健康无关个体与精神分裂症患者GRIN1基因5′端-855 G/C和-1140 G/A两个SNP位点的遗传多态性，并探讨其与精神分裂症的关联性，为法医学鉴定提供参考数据。

1 材料与方法

1.1 材料

对照组：183例中国北方汉族健康无关个体血液样本（男性86例，女性97例），由中国医科大学法医学院血清学教研室提供（问卷调查三代内无精神疾病）。

实验组：172例偏执型精神分裂症患者血液样本（男性80例，女性92例）收集自辽宁省第三人民医院。精神分裂症诊断标准同时符合美国精神病学会《精神障碍诊断和统计手册（第 4版）》（DSM-Ⅳ）和《中国精神障碍分类与诊断标准（第3版）》（CCMD-3）。血液样本采集遵循知情同意原则。

1.2 方法

常规酚-氯仿法抽提DNA。扩增引物由TaKaRa公司合成，正向引物：5′-GGGGCGTTTGCTGTTAGGTC-3′；反向引物：5′-CGGAACATCTGCTCGTGCTT-3′。PCR 反应总体系为 20 μL，包括模板 5～10 ng，2×GC缓冲液Ⅰ（Mg2+Plus） 10 μL，dNTP 16 nmol，正反向引物各4pmol。rTaq聚合酶（TaKaRa公司）1U。扩增条件：94℃ 1min；94℃ 1min，58℃ 1min，72℃ 1min，循环30次；72℃ 2min，4℃保温。

限制性内切酶处理与分型：（1）-855 G/C酶切体系为 20μL，含 2μL 10×NEB 缓冲液 2，1U 限制性内切酶BseRⅠ，2μL PCR产物，充分混匀后37℃反应2h。反应产物用T=6%、C=3.3%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，银染显带。（2）-1140 G/A 酶切体系为 20μL，含2 μL 10×NEB 缓冲液 2，1 U 限制性内切酶 BsaJⅠ，2μL PCR产物，充分混匀后60℃反应2h。反应产物用T=6%、C=5%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，银染显带[5]。

1.3 数据统计分析

采用直接计数法计算基因型频率和等位基因频率，进行Hardy-Weinberg平衡检验。对照组和实验组间基因型和等位基因频率分布的差异用SPSS 13.0统计软件进行检验。

2 结 果

2.1 -855 G/C与-1140 G/A位点的遗传多态性分布

在-855 G/C位点中，检出3种基因型：GG、GC、CC；在-1140 G/A位点中，检出2种基因型：GG、GA。经χ2检验，所调查的数据基因型分布均符合Hardy-Weinberg 平衡定律（P＞0.05）。

2.2 -855 G/C、-1140 G/A位点遗传多态性在两组中的分布及比较

-855 G/C、-1140 G/A位点遗传多态性在两组中的分布及比较见表1～2。-855 G/C位点遗传多态性分布在组间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；-1140 G/A位点遗传多态性分布在组间差异具有统计学意义，实验组基因型GG的频率低于对照组7.11%，实验组等位基因A的频率高于对照组3.56%（P＜0.05）。

按性别分类比较，-855 G/C位点基因型分布在女性组间差异具有统计学意义（P＜0.05），实验组基因型GG的频率高于对照组14.18%，实验组等位基因G的频率高于对照组6.55%。-1140 G/A位点遗传多态性分布在女性组间差异具有统计学意义（P＜0.05），实验组基因型GG的频率低于对照组8.70%，实验组等位基因A的频率高于对照组4.35%。然而，-855 G/C位点和-1140 G/A位点基因型分布在男性组间差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 -855 G/C位点遗传多态性在对照组与实验组中的分布 ［n（%）］

表2 -1140 G/A位点遗传多态性在对照组与实验组中的分布 ［n（%）］

3 讨 论

人类GRIN1基因位于9q34.3，共有22个外显子，全长约31kb，其基因表达产物调控早期大脑发育突触的形成、维持等。谷氨酸系统活动异常能影响神经元的可塑性和引起神经毒性[1]。一般来讲，基因的启动子区域（5′端非翻译区）是调控转录、翻译的重要靶点，其内部序列的变异可能影响基因表达产物功能蛋白量的变化。本研究的-855 G/C、-1140 G/A两个SNP位点位于该基因的5′端非翻译区。结果显示，-855 G/C位点在女性组间基因型分布差异具有统计学意义；-1140 G/A位点在组间以及女性组间的基因型和等位基因频率分布差异都具有统计学意义。推测可能是相应的碱基替换影响了转录，进而编码受体的结构和功能发生改变，也可能引起谷氨酸神经递质产生量的变化，具体机制有待深入研究。

Hung等[4]利用PCR-SSCP和RFLP的方法研究了GRIN1启动子区域的-855 G/C和-1140 G/A，结果这两个SNP位点没有显示出与精神分裂症的遗传关联性。Begni等[6]对意大利人群的研究证实GRIN1基因上-855 G/C多态性与精神分裂症有关联，提出GRIN1可能是精神分裂症敏感的候选基因之一。Zhao等[7]检测了中国汉族群体5个GRIN1基因的SNP，发现位于5′非翻译区-855 G/C位点的C等位基因在实验组中高频表达，提示-855 G/C是精神分裂症候选SNP位点。Galehdari等[8]采用PCR-RFLP法研究了GRIN1基因启动子区-855 G/C在伊朗人群中的多态性分布，通过病例对照研究揭示该位点多态性分布与精神分裂症很强的相关性，进而提出，C等位基因与精神分裂症发病风险的增加有关。研究[9]提示，不同的结果可能是人群的遗传异质性造成。

在本研究中，按性别分类统计比较后，-855 G/C位点基因型分布在女性组间的差异具有统计学意义（P＜0.05），推测-855 G/C位点单碱基突变可能在精神分裂症的发生中起到一定的调控作用。GRIN1基因启动子区域的-1140 G/A位点基因突变可能与精神分裂症发生的遗传病因学有关，同时，精神分裂症发生的遗传学因素可能存在性别倾向。人类精神疾病的发生有环境因素与遗传学倾向，多基因座的综合分析研究应是揭示精神疾病发病原因的有效途径。

[1]李忠杰，王保捷，丁梅，等.谷氨酸受体基因单核苷酸多态性与精神分裂症的关联[J].法医学杂志，2008，24（5）：369-374，377.

[2]赵靖平.精神分裂症[M].北京：人民卫生出版社，2012：9.

[3]VanDongen AM，VanDongen HM.Effects of mRNA untranslated regions on translational efficiency of NMDA receptor subunits[J].Neurosignals，2004，13（4）：194-206.

[4]Hung CC，Chen HY，Chen CH.Systematic mutation analysis of the human glutamate receptor，ionotropic，N-methyl-D-aspartate 1 gene （GRIN1） in schizophrenic patients[J].Psychiatr Genet，2002，12（4）：225-230.

[5]李忠杰，王保捷，丁梅，等.GRIN1基因-855 G/C和-1140 G/A 位点遗传多态性[J].法医学杂志，2009，25（3）：217-218.

[6]Begni S，Moraschi S，Bignotti S，et al.Association between the G1001C polymorphism in the GRIN1 gene promoter region and schizophrenia[J].Biol Psychiatry，2003，53（7）：617-619.

[7]Zhao X，Li H，Shi Y，et al.Significant association between the genetic variations in the 5′end of the N-methyl-D-aspartate receptor subunit gene GRIN1 and schizophrenia[J].Biol Psychiatry，2006，59（8）：747-753.

[8]Galehdari H，Pooryasin A，Foroughmand A，et al.Association between the G1001C polymorphism in the GRIN1 gene promoter and schizophrenia in the Iranian population[J].J Mol Neurosci，2009，38（2）：178-181.

[9]Schork NJ，Greenwood TA，Braff DL.Statistical genetics concepts and approaches in schizophrenia and related neuropsychiatric research[J].Schizophr Bull，2007，33（1）：95-104.