蓝莓花青素的纯化及镇痛、抗炎药效学研究

王 静，马养民，逯文静

(陕西科技大学化学与化工学院，教育部轻化工助剂化学与技术重点实验室，陕西西安710021)

蓝莓，学名越橘，杜鹃花科(Ericaceae)越橘属(Vaccinium Linn.)植物，果实营养丰富，含有维生素、蛋白质、花青素及黄酮等多种活性成分，其中花青素含量位居所有水果、蔬菜之首。自然状态下，植物体内的花青素常与多种单糖结合形成糖苷，故又称花青苷。花青素具有抗氧化、抗肿瘤、保护肝脏、增强视力等多种生理功能。研究表明，花青素安全、低毒，口服45min后可进入人体各个组织器官，具有良好的生物利用度［1-3］。蓝莓果大约含有5种以花青素为母本的花青苷［4］，成分复杂，对花青素的纯化造成了一定困难;大孔树脂吸附法是近年来花青素纯化常用的方法之一。目前，蓝莓花青素的生理活性研究多集中在抗氧化能力的评估、视力保护及抗肿瘤等方面，然而镇痛和抗炎作用的研究却鲜有报道。本文比较了2种大孔吸附树脂对花青素的纯化效果，并采用小鼠受热致痛法和二甲苯致小鼠耳廓肿胀法对纯化后的花青素进行镇痛抗炎实验，进一步完善花青素生物活性研究，对蓝莓食品的开发和深加工以及花青素的卫生保健应用提供发展方向。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

蓝莓 2010年采自陕西省宁陕县;D101树脂 山东鲁抗医药股份有限公司;Amberlite XAD-7树脂 北京慧德易科技有限责任公司;95%乙醇、甲醇、盐酸、二甲苯、乙醚均为市售分析纯;三氟乙酸(TFA)Sigma公司;昆明种健康小白鼠(雄性)体重18～25g，清洁级，第四军医大学提供，合格证号:SCXK(军)2007-007。

紫外-可见分光光度计DR5000 美国Hach公司;数控超声波清洗器KQ2200DE 昆山市超声仪器有限公司;恒温水浴锅R201L 上海申生科技有限公司;干燥箱101-1 上海市实验仪器总厂;离心机800B上海安亭科学仪器厂;酸度计PB-10 Sartorius公司;电子分析天平BS2202S Sartorius公司。

1.2 实验方法

1.2.1 蓝莓花青素的纯化 首先进行花青素提取，将蓝莓果打碎，酸化的60%乙醇溶液于30℃水浴中超声提取40min，提取液过滤，旋转薄膜蒸发仪减压浓缩。将浸膏分成两份，一份用D101树脂纯化，另一份用Amberlite XAD-7树脂纯化。

D101树脂纯化时，浸膏与树脂体积1∶5，湿法装柱，用乙醇洗脱2～3个保留体积(BV)至洗脱液无色透明，再用蒸馏水洗至无醇味，上样。样品反复吸附3次，每次6～8h，吸附完全后先用蒸馏水淋洗，除去杂质，检查流出液至Molish反应为阴性。再分别用20%、40%、60%、95%乙醇梯度洗脱，收集流出液，减压浓缩，冷冻干燥，测量其中总花青素含量。(Molish反应:用于检测糖的存在。取试样于试管中，加α-萘酚试剂数滴，摇匀后沿试管壁滴加浓硫酸或浓盐酸，看是否有紫红色环。)

浸膏与Amberlite XAD-7树脂体积1∶3，湿法装柱，先用95%乙醇洗脱2～3个BV，再用蒸馏水洗至无醇味，上样，充分吸附后开始洗脱。先用含0.01%HCl的蒸馏水淋洗，至水溶液澄清为止。再用含0.1%TFA的甲醇溶液洗脱，收集流出液，减压浓缩，冷冻干燥后测量其中总花青素含量。

选取D101树脂纯化后含量为35%的蓝莓花青素进行镇痛及抗炎药理活性研究。

1.2.2 总花青素的含量测定 pH示差法［5］测定总花青素含量。纯化后花青素分别用pH1.0的0.025mol/L氯化钾缓冲溶液和pH4.5的0.4mol/L乙酸钠缓冲溶液溶解并稀释，紫外-可见分光光度计分别测定其在525nm和700nm的吸光值，用式(1)计算吸光值A:

总花青素含量按下式计算:

其中，A:吸光值，由式(1)计算得到;M:矢车菊色素-3-O-葡萄糖苷的相对分子质量(449.2g/mol);DF:稀释因子;ε:矢车菊色素-3-O-葡萄糖苷的消光系数(26900L·cm-1·mol-1);l:比色皿宽度(1cm)。

由花青素的质量可以确定花青素的质量百分含量。

1.2.3 小鼠尾部受热甩尾法镇痛实验 将小鼠尾部约1/3浸入(50±0.5)℃的恒温水浴中，记录小鼠自尾部被放入水中起至出现甩尾的时间(s)，作为小鼠的正常痛阈，剔除正常痛阈小于5s或大于30s的小鼠。选择合格的雄性昆明小鼠48只，随机分成6组，每组8只。以皮下注射方式给药，空白组注射生理盐水，其余5组分别注射不同浓度的花青素溶液(给药量分别为 1、3、10、30、100mg/kg)，编号为花青素A、B、C、D、E。每组小鼠给药前重复测定2次痛阈，取平均值作为该鼠的基础痛阈。给药后10、20、30、40、50、60min测量小鼠的痛阈，痛阈值超过60s者按60s计算，记录结果，按下式计算药品的痛阈提高率，利用t检验比较组间差异。

其中，P:痛阈提高率(%);T:给药后小鼠痛阈(s);T0:给药前小鼠基础痛阈(s)。

1.2.4 二甲苯致小鼠耳廓肿胀法抗炎实验 采用小鼠耳廓肿胀法研究花青素对二甲苯引起的小鼠耳廓肿胀的抗炎作用。取昆明小鼠70只，随机分成7组(a～g组)，每组10只。a组为空白组(生理盐水)、b～g组分别为花青素 1、3、10、30、50、100mg/kg 剂量组。以上7组分别以皮下注射给予生理盐水或相应剂量的花青素0.01mL/g，每日1次，连续6日。末次注射后1h，将40μL致炎剂二甲苯均匀涂于各个小鼠右耳廓致炎，左耳对照。致炎后1h断椎处死，沿耳廓基线剪下双耳，用直径9mm的打孔器分别在左右两耳的同一部位打下圆耳片，于分析天平称重，以左右耳片的重量差作为肿胀度(mg)，计算每组右耳廓肿胀度，并通过式4计算其肿胀抑制率，比较组间差异。

1.2.5 统计学分析 所有数据采用“均数±标准差”表示，用SPSS 17.0统计软件进行统计分析，组间比较进行单因素方差ANOVA检验，重复测量数据采用重复测量方差分析，多重比较采用LSD法。

2 结果与讨论

2.1 蓝莓花青素的纯化

从表1看出，D101树脂的纯化效果与洗脱梯度有关，经60%乙醇洗脱，总花青素含量最高，达到35%;而Amberlite XAD-7树脂纯化后，花青素含量接近50%，效果较好。

表1 纯化后总花青素含量Table 1 The total content anthocyanins after purification

2.2 蓝莓花青素对小鼠尾部受热致痛反应的影响

花青素各剂量组与空白组比较，均有较显著性差异。给药后40min镇痛效果最为明显(p＜0.01)，实验得到10mg/kg剂量的花青素的镇痛效果最好。

由表3看出，小鼠痛阈提高率不仅与花青素浓度有关，也与花青素体内代谢时间相关。

由表3看出，5个实验剂量的花青素均具有较好的镇痛效果，且痛阈提高率随花青素浓度的增加而呈现出先提高后降低的趋势。其中花青素剂量为10mg/kg，给药40min后痛阈提高率最大，镇痛效果最好;40min后，镇痛效果逐渐减弱，但是60min时仍具有一定镇痛效果。

2.3 蓝莓花青素对二甲苯致小鼠耳廓肿胀的影响

不同剂量花青素给药组对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀均有一定的抑制作用，与空白组相比，均具有显著性差异，但是花青素各剂量组之间并无显著性差异。

表2 花青素对小鼠尾部受热致痛反应的影响(±s，n=8)Table 2 The effects of heat test on mice after injecting anthocyanins(±s，n=8)

表2 花青素对小鼠尾部受热致痛反应的影响(±s，n=8)Table 2 The effects of heat test on mice after injecting anthocyanins(±s，n=8)

注:与空白组比较*p＜0.05，＊＊p＜0.01;表4同。

给药后痛阈(s)组别 剂量(mg·kg-1)±0.4 6.0±0.2花青素A组 1 6.5±0.1 7.2±0.7* 8.0±0.7* 9.0±0.8＊＊ 9.9±1.0＊＊ 7.9±0.6* 7.5±0.5*花青素B组 3 5.8±0.4 6.4±0.4* 7.1±0.5＊＊ 7.8±0.7＊＊ 9.0±0.6＊＊ 7.3±0.5* 6.9±0.7*花青素C组 10 4.0±0.2 6.0±0.5* 8.8±0.2＊＊ 10.5±0.9＊＊11.0±1.2＊＊ 7.3±0.6＊＊ 7.0±0.8*花青素D组 30 4.5±0.7 6.3±0.7* 7.5±0.5* 8.3±0.6* 9.9±0.6＊＊ 6.9±0.5* 6.5±0.4*花青素E组 100 4.8±0.3 6.5±0.4＊＊ 7.1±0.7＊＊ 8.0±0.7* 9.1±0.7＊＊ 7.5±0.6＊＊ 6.2±0.2 10min 20min 30min 40min 50min 60min空白组 - 5.9±0.2 6.0±0.6 6.1±0.8 6.2±0.5 6.0±0.3 6.0基础痛阈(s)*

表3 花青素对小鼠尾部受热致痛反应的痛阈提高率Table 3 The improvement of pain threshold on mice after injecting anthocyanins

表4 花青素对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀的影响(±s，n=10)Table 4 The protection of anthocyanins on xylene-induced ear edema in mice(±s，n=10)

表4 花青素对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀的影响(±s，n=10)Table 4 The protection of anthocyanins on xylene-induced ear edema in mice(±s，n=10)

组别 剂量(mg·kg-1)肿胀度(mg)肿胀抑制(%)空白对照组 a组- 7.2±3.1 -花青素样品组68.1 b组 1 4.4 ±1.9＊＊ 38.9 c组 3 3.5 ±2.0＊＊ 51.4 d组 10 2.9 ±1.3＊＊ 59.7 e组 30 2.0 ±1.1＊＊ 72.2 f组 50 2.2 ±1.4＊＊ 69.4 g组 100 2.3 ± 1.7＊＊

实验结果表明，花青素能够提高小鼠的痛阈值，抑制由二甲苯所致的小鼠耳廓肿胀，可能与花青素属于小分子化合物，易吸收，能穿越血脑屏障，抑制炎症细胞因子的产生有关［6］。

3 结论

3.1 利用两种大孔树脂对蓝莓果中提取得到的花青素粗品进行纯化，纯化后样品含量均可达到国际入药要求(＞24%)［7］。经 Amberlite XAD-7 树脂纯化得到的花青素样品含量接近50%，D101树脂纯化后也可达到35%。虽然Amberlite XAD-7树脂纯化效果较好，但价格昂贵;然而相同浸膏时D101树脂的用量又较大，所以在工业生产中，应根据实际生产情况采取经济、高效的纯化路线。

3.2 首次利用从蓝莓果中提取并纯化的花青素进行镇痛及抗炎作用研究。具体实验采用小鼠受热致痛法和小鼠二甲苯致耳廓发炎法，结果表明蓝莓花青素可明显提高小鼠的痛阈值并抑制耳廓肿胀，且效果良好。本研究不仅证实了蓝莓花青素的镇痛、抗炎生理活性，丰富了蓝莓作为天然植物的药用保健价值，为蓝莓食品的开发和深加工提供发展思路，更为花青素资源的进一步研究、利用提供了理论基础。

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