营养液培养糙米发芽富集GABA工艺条件优化

蒋 静，马 涛

(1.沈阳农业大学食品学院，辽宁沈阳110866;2.渤海大学化学化工与食品安全学院，辽宁锦州121013)

发芽糙米含有丰富的维生素A、B、E和矿物元素钾、钠、铁、锌等，而且还含有多种促进人体健康和防治疾病的成分，如谷胱甘肽、谷维素和阿魏酸，特别是糙米中的γ-氨基丁酸(GABA)含量在发芽时会大幅增加［1］。GABA具有改善脑机能，调整血压，镇静神经，促进长期记忆，促进生长激素分泌，调节肾功能以及肝功能等作用［2］，因而受到国内外广泛关注。糙米发芽过程中，内源的谷氨酸脱羧酶(Glutamate decarboxylase，GAD)被活化，将糙米中的谷氨酸转化为GABA，从而显著的提高GABA的含量，而GAD活性又受环境pH、谷氨酸浓度等因素的影响［3］。谷氨酸脱羧会造成反应体系的pH不断上升，使反应速度下降，因此一般在缓冲体系中进行转化，而研究表明，不同的缓冲体系及其离子强度对GABA产量也有较大影响，张晖等研究发现PBS缓冲体系比MES缓冲体系中 GABA的产量高 28%［4］;谷氨酸钠(MSG)相对谷氨酸溶解性好，价格低廉，且对发芽糙米富集GABA效果更佳。因此，本实验采用谷氨酸钠(MSG)替代谷氨酸添加到PBS缓冲溶液中制成营养液培养糙米发芽。根据单因素结果，用 Box-Behnken响应面分析法对营养液培养糙米发芽富集GABA工艺条件进行优化，以期为糙米发芽富集GABA提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

供试糙米 中稻股份有限公司，品种为辽星1号;GABA标准品 Sigma公司;谷氨酸钠(味精，谷氨酸钠＞99%，无盐)中外合资武汉味全食品有限公司;次氯酸钠，分析纯，有效氯为9% 广东汕头市西陇化工厂;重蒸苯酚，分析纯 武汉天源生物技术有限公司;磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、硼砂、硼酸和无水乙醇均为分析纯 国药集团化学试剂有限公司。

HH.B11-500电热恒温培养箱 上海跃进医疗器械厂;HH-601A超级恒温水浴锅 江苏省金坛市医疗仪器厂;SC-279GA海尔冰柜 海尔公司;UV1200型紫外可见分光光度计 上海正慧工贸有限公司;PB-20标准pH计、1245电子天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 发芽糙米的制备 发芽糙米的制备工艺流程如下:原料筛选→精选→杀菌→清洗→浸泡→发芽→清洗→干燥→成品。

为了有效控制糙米发芽过程微生物污染，将精选后的糙米用1.0%的次氯酸钠溶液浸泡5min(加入量以刚好淹没糙米为宜，下同［5］)，自来水冲洗3遍，加入4倍体积的水，恒温浸泡。糙米浸泡后从烧杯中取出，用去离子水清洗，均匀地摊于铺有四层纱布的培养皿中，其中纱布已用营养液润湿。发芽过程中每隔4h加入1mL营养液并上下翻动糙米，以保证糙米在发芽期间的湿润状态并防止种子部分接触水面积时间较久腐烂发臭，并于一定温度的培养箱中进行培养发芽。发芽结束后，用去离子水清洗，于55℃烘箱中终止活性，干燥至5h，取出备用。

1.2.2 糙米吸水率的测定 将称取的糙米分别放入20、25、30、35、40℃的恒温水浴锅中浸泡，每隔 2h 测定一次吸水率。糙米吸水率的计算公式如下:

1.2.3 GABA含量的测定 参考姚森［6］的方法并加以改进，取2.5g发芽糙米，加适量蒸馏水研磨匀浆，然后定容至50mL，于30℃水浴中浸提2h，过滤后取滤液 0.5mL，加入 0.2mL 0.2mmol/L硼酸缓冲液(pH9.0)，1mL 6g/100mL重蒸苯酚溶液，0.4mL有效氯含量9%的NaClO溶液，充分振荡，置于沸水浴10min，再立即置于冰水浴中20min并不断振荡，待溶液出现蓝绿色后，加2mL体积分数60%的乙醇溶液，再次振荡均匀，静置后于645nm波长处比色，测定其吸光度值A，通过GABA的标准曲线Y=0.005X-0.032(Y为 GABA的浓度，mg/mL;X为 A645，R2=0.998)求出GABA含量。

1.2.4 单因素实验 通过发芽温度、发芽时间、营养液pH及MSG浓度4个因素实验，研究其对发芽糙米GABA含量的影响。

1.2.5 实验条件优化 根据单因素实验结果，以发芽温度(A)、发芽时间(B)、营养液pH(C)及MSG浓度(D)四个因素与发芽糙米中GABA含量进行响应面实验设计，优化糙米发芽工艺。根据Box-Behnken的中心组合设计原理［7］，通过Design Expert 8.0软件对实验数据进行分析，预测糙米发芽的最佳工艺条件。各因素及水平编码如表1所示。

表1 Box-Behnken实验因素及水平Table 1 Four main induction conditions and their levels for Box-Behnken design

1.2.6 最佳发芽条件的验证 根据优化实验结果，采用Design Expert软件求得回归方程，以发芽糙米GABA含量最大化为目标，计算得到培养发芽糙米工艺参数和理论含量，将得到的工艺参数修正以便于操作后，进行验证实验，评价工艺参数的可靠性。

2 结果与分析

2.1 浸泡温度和时间对糙米吸水率的影响

糙米浸泡温度和时间与吸水率的关系见图1，从图1中可以看出，浸泡温度对糙米吸水率有较大的影响。在30、35、40℃三个浸泡温度条件下糙米吸水率较快。而在20、25℃浸泡条件下，需要较长的浸泡时间才达到一定的吸水率。生产过程中提高温度有利于缩短浸泡时间，减少营养成分流失，但浸泡温度也不能过高，过高会导致热溶性物质流失，或者表层淀粉糊化［8］。实验发现，在大于30℃条件下浸泡，浸泡的糙米易产生发酵味，对后期培养糙米发芽产品品质有严重影响。考虑生产实际，浸泡温度为30℃比较适宜。

图1 不同浸泡条件下糙米的吸水率Fig.1 Effect of soaking condition on the water absorbability of brown rice

2.2 单因素实验结果

2.2.1 发芽温度对发芽糙米GABA含量的影响 将糙米30℃温度下浸泡12h，用谷氨酸钠(MSG)浓度为2.0mg/mL的pH5.6 PBS缓冲溶液(0.05mol/L)作为营养液在不同温度 20、25、30、35、40℃下培养 24h，其它过程同“1.2.1”，以GABA含量为考察指标。结果如图2所示。

图2 发芽温度对GABA含量的影响Fig.2 Effect of germination temperature on the GABA content

由图2可看出，在一定温度范围内，GABA含量随发芽温度升高而升高。在30℃时达到最大值，随后下降。温度过高和过低对糙米种子发芽均不利，适宜的温度是增加营养物质转化合成GABA的必要条件［9］。本实验条件下，发芽温度30℃较为适宜。

2.2.2 发芽时间对发芽糙米GABA含量的影响 将糙米30℃温度下浸泡12h，用谷氨酸钠(MSG)浓度为2.0mg/mL的pH5.6 PBS缓冲溶液(0.05mol/L)作为营养液在30℃下分别培养 8、16、24、32、40h，其它过程同“1.2.1”，以GABA含量为考察指标。结果如图3所示。

图3 发芽时间对GABA含量的影响Fig.3 Effect of germination time on the GABA content

由图3可看出，GABA含量在培养过程中呈现先增长后下降的趋势。24h时达到最大值;24h以后呈下降趋势。分析其原因可能是随着培养时间的延长，GABA在转氨酶的作用下，转换成琥珀酸半醛，使GABA含量下降［10］。在本实验条件下，发芽时间24h较为适宜。

2.2.3 营养液pH对发芽糙米GABA含量的影响将糙米 30℃温度下浸泡 12h，分别用谷氨酸钠(MSG)浓度为 2.0mg/mL 的 pH5.3、5.6、5.9、6.2、6.5PBS缓冲溶液(0.05mol/L)作为营养液在30℃下培养24h，其它过程同“1.2.1”，以GABA含量为考察指标。结果如图4所示。

图4 pH对GABA含量的影响Fig.4 Effect of pH on the GABA content

由图4可看出，当pH5.6时，发芽糙米中GABA含量最高，这与资料报道相一致［11］。GABA是生物体在逆境条件下缓解细胞酸化对自身毒害作用的产物，其合成途径为 Glu在 GAD催化条件下形成GABA，弱酸条件能促进GABA的合成［12］。植物组织中GAD的最适pH为5～6，GABA转氨酶最适pH则为9左右。酸性条件利于形成逆境，从而使发芽糙米中GABA大量积累。当pH＞5.6时，随着营养液pH的继续增加，GABA的含量呈显著下降趋势，这是由于在较高pH环境下GAD活性相对降低，GABA转氨酶相对增加，从而影响发芽糙米富集GABA。在本实验条件下，营养液pH5.6较为适宜。

2.2.4 MSG浓度对发芽糙米GABA含量的影响 将糙米30℃温度下浸泡12h，分别用谷氨酸钠(MSG)浓度为1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mg/mL 的 pH5.6 PBS 缓冲溶液(0.05mol/L)作为营养液在30℃下培养24h，其它过程同“1.2.1”，以GABA含量为考察指标。结果如图5所示。

图5 MSG对GABA含量的影响Fig.5 Effect of MSG on the GABA content

由图5可看出，随谷氨酸钠浓度增加，GABA含量呈现上升和下降的趋势。分析其原因可能是随着谷氨酸钠浓度的增加，谷氨酸脱羧酶可利用的底物逐渐增多，当达到2.0mg/mL时，底物与酶达到一个最适比例，随后浓度的增加造成营养液中离子浓度的增加，从而给细胞壁较大压力，堵塞营养物质的运输通道，使营养物质不能自由进出细胞，从而不利于GABA的合成与运送［13］。在本实验条件下，MSG浓度为2.0mg/mL时较为适宜。

2.3 响应面分析法优化糙米发芽条件结果分析

2.3.1 实验因素水平编码与实验结果 应用Design-Expert 8.0软件进行Box-Behnken中心组合实验设计，依次进行浸泡培养发芽，以发芽糙米中GABA含量为响应值(Y)，进行响应面实验，实验设计及结果如表2所示。

表2 Box-Behnken实验设计及结果Table 2 Test design and results of Box-Behnken design

续表

2.3.2 回归模型的建立及统计分析 根据表2的实验结果，通过Design Expert 8.0软件处理确定回归方程，该实验的回归方程为:

回归模型进行方差分析及可信度分析结果见表3。

根据α=0.05显著水平剔除不显著项，简化后的回归方程为:Y=210.8+14.09A+9.8B+15.73C+12.05D-20AB-10.88AC-26.82A2-16.95B2-22.84C2-26.23D2

根据表3可知，该回归模型显著(p＜0.0001)方程的一次性和二次项的影响都显著，且交互项AB、AC也显著，且该模型极显著(p＜0.01)，因变量与自变量之间的线性关系显著(R2=0.9428)，模型调整复相关系数=0.9155，说明该模型能解释91.55%响应值的变化，拟合程度较好。失拟项不显著(p＞0.05)，说明本实验所得二次回归方程能很好地对响应值进行预测［14］。

2.3.3 响应面因素水平的优化 回归方程中影响显著的交互项所做的响应曲面见图6。

根据回归方程绘制响应面分析图，运用Design Expert 8.0软件对模型进行分析，寻求发芽糙米GABA含量最大值的稳定点及对应的因素水平，由图6可知，回归模型存在稳定点，稳定点即极大值点，通过对回归模型求一阶偏导，得到各因素A、B、C、D的编码值为 0.154、0.100、0.269、0.172，利用编码公式Xi=(Xj-X0)/Δj将上述编码值转变为实际参数为:发芽温度30.7℃、发芽时间24.8h、营养液pH5.68和MSG浓度2.09mg/mL，此时发芽糙米GABA含量为215.5mg/100g。

2.4 验证实验

对最佳工艺条件进行验证实验，重复实验5次，得发芽糙米GABA含量实测值为210.8mg/100g，与理论值215.5mg/100g接近，可以用此模型预测并指导生产实际。

3 结论

表3 回归方程的统计分析Table 3 Statistical analysis of regression equation

采用Box-Behnken响应面法建立影响因素的二次回归模型，对数据进行分析，糙米在30℃浸泡12h后，其富集 GABA的最佳工艺条件为发芽温度30.7℃、发芽时间24.8h、营养液pH5.68和MSG浓度2.09mg/mL。拟合实验误差小，可为实际预测和评价发芽糙米GABA含量提供理论依据。

图6 各两因素交互作用对GABA含量影响的响应曲面Fig.6 Response surface and contour plots showing the effects of pairwise interactions among various process conditions on the GABA content

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