铅胁迫对凤眼莲氮代谢关键酶的影响

泉州师范学院化学与生命科学学院 洪伟超 李裕红 徐旸旸



铅胁迫对凤眼莲氮代谢关键酶的影响

泉州师范学院化学与生命科学学院 洪伟超 李裕红*徐旸旸

该文研究了系列浓度Pb2+胁迫6h、6d、20d、60d对凤眼莲氮代谢关键酶活性的影响。结果表明：无论有无Pb2+污染存在，凤眼莲的根、叶的GS活性大于NADH-GOGAT活性，且GS活性和NADH-GOGAT活性均表现为叶＞根。6h、6d、20d的 0.1～2 mmol·L-1Pb2+胁迫均使根和叶的GS活性降低，但在Pb2+胁迫60 d后，随着凤眼莲新生组织的萌生，各处理浓度组的GS活性均出现不同程度的上升，凤眼莲叶片的GOGAT活性在Pb2+暴露60 d后极显著上升。

Pb2+凤眼莲 谷氨酰胺合成酶 谷氨酸合酶

铅(Pb2+) 是环境污染最严重、危害最大的重金属元素之一，属“五毒”重金属元素之一。凤眼莲()是多年生单子叶植物, 属雨久花科凤眼兰属, 原产于南美洲，是净化水体的优良植物材料[1]。近年来，国内外有关铅对水稻、小麦等农作物氮代谢关键酶活性的影响已有较多报道[2],但研究Pb2+对凤眼莲氮代谢关键酶活性的影响的报道较少。

逆境对植物氮素代谢的影响是植物逆境生理研究的重要内容之一。在高等植物中，无机氮以氨的形式掺入到碳骨架上，形成有机氮是最重要的生物化学过程之一，硝酸盐还原产生的氨、光呼吸作用以及种子叶片储存蛋白质降解等过程产生的氨都是以氨基酸的形式同化成有机氮。谷氨酰胺合成酶(GS)和谷氨酸合酶（GOGAT）耦联形成的循环反应是高等植物体内氨同化的主要途径[3]。本实验研究凤眼莲叶片和根在不同浓度Pb2+处理下的氮代谢关键酶的变化，旨在揭示重金属Pb2+对凤眼莲营养代谢的约束机制，为研究凤眼莲对重金属的净化机制，以指导利用水生植物凤眼莲解决水体重金属污染的实际问题提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验处理

凤眼莲采自福建省泉州惠安洛阳江水域，移取生长状况良好、大小相近的凤眼莲于室内自来水暂养3天后作为试验材料；设定6组Pb2+浓度梯度对材料进行试验培养；取6个大桶装入15L的自来水，静置3d曝气后，分别加入不同浓度的Pb(NO3)2溶液搅匀，使得Pb2+浓度分别为0 mmol/L（对照）、0.1mmol/L、0.25mmol/L、0.5mmol/L、1.0mmol/L、2.0 mmol/L,然后取18个大小一样的水培盆(直径约为35cm，高约为15cm)分别装入处理后的水各4L（每种浓度为3个，培养盆共18个），取高度、长势且根系长度较一致的凤眼莲栽入盆中,每盆3～4 株。培养6 h、6 d、20 d、60 d后分别取样。

1.2 试验测定方法

1.2.1酶液的提取

按文献[4]的方法进行，重复3次。从每处理组的3盆中随机剪取根、叶材料，各组称取凤眼莲根、叶大约2g。立即加4mL抽提缓冲液冰浴快速研磨，将研磨液移入离心管，6℃离心22min（15000 rpm），上清液即为酶液，置于4℃保存备用。

1.2.2 GS活性的测定

按文献[5]的方法进行。1个GS活性单位定义为每分钟于37℃产生1 μmol的γ-谷氨酰异羟肟酸所需的酶量。

1.2.3 NADH-GOGAT活性的测定

NADH-GOGAT活性测定按文献[6]的方法进行。NADH-GOGAT酶活性单位定义为: 30℃每分钟反应混合液减少1 μmol NADH为1个酶活性单位。

2 结果与分析

2.1 Pb2+对凤眼莲叶、根GS活性的影响

2.1.1 Pb2+胁迫对凤眼莲叶GS活性的影响

研究结果如图1所示，胁迫6h后，0.25 mmol·L-1Pb2+处理使叶GS活性极显著升高（P <0.01），其活性比对照组高出22.1%，在0.1 mmol·L-1、1 mmol·L-1和2 mmol·L-1Pb2+下，相对于无污染对照组，叶片的GS活性分别被抑制17.2%、22.3%和18.9%。胁迫6 d后，0.1～0.5 mmol·L-1Pb2+胁迫使叶片的GS活性极显著降低，活性最低点在0.5 mmol·L-1Pb2+处，活性最高点在1 mmol·L-1Pb2+胁迫组，其活性比对照组高出0.43%，当Pb2+浓度达2 mmol·L-1时，叶GS活性受抑制。胁迫20 d后，随胁迫浓度的增加，叶GS活性呈现波浪型变化，在0.1 mmol·L-1Pb2+处理下略微上升，在0.25 mmol·L-1Pb2+处理下略微下降，然后在0.5 mmol·L-1Pb2+处显著上升，又在1 mmol·L-1Pb2+处显著下降，最后在2 mmol·L-1Pb2+处略微上升。胁迫60 d后，除1 mmol·L-1Pb2+处GS活性显著下降其余各组均极显著下降，活性最低点在2 mmol·L-1Pb2+处，其活性比对照组低43.9%。

另外从图1可以看出，在同一处理浓度下随着胁迫时间的增加，叶片的GS活性均出现不同程度的下降，胁迫6 d与胁迫6h相比差异显著。但是胁迫60 d后，叶片的GS活性均出现不同程度的上升，1 mmol·L-1Pb2+胁迫60 d与胁迫20 d相比，其GS活性上升136%。

图1 Pb2+对凤眼莲叶片GS活性的影响

（注：*表示差异达显著水平，<0.05；**表示差异达极显著水平，<0.01）

2.1.2 Pb2+胁迫对凤眼莲根GS活性的影响

研究结果如图2所示，胁迫6h后，除1 mmol·L-1Pb2+处GS活性略微上升，其余各组均极显著下降，活性最低点在0.25 mmol·L-1Pb2+处，其活性比对照组低64.8%。胁迫6 d后，0. 5 mmol·L-1Pb2+处GS活性略微上升，其余各组均出现不同程度下降，活性最低点在0.25 mmol·L-1Pb2+处，其活性比对照组低41.6%。胁迫20 d后，0.1～2 mmol·L-1Pb2+胁迫使根的GS活性极显著受抑制呈直线下降，与对照组相比，被抑制了41.7%～102%的活性；胁迫60 d后，0.1 mmol·L-1Pb2+处GS活性略微上升，其余各组均出现不同程度下降，活性最低点在0.25 mmol·L-1Pb2+处，其活性比对照组低57.4%。

图2 Pb2+对凤眼莲根GS活性的影响

（注：*表示差异达显著水平，<0.05；**表示差异达极显著水平，<0.01）

从图2还可看出，随着胁迫时间的增加，在同一处理浓度下根的GS活性均出现不同程度的下降，胁迫6 d与胁迫6h相比差异显著，但是胁迫60 d后叶片的GS活性除了0.25 mmol·L-1Pb2+处略微下降，其余各处理浓度的GS活性均出现不同程度的上升。

2.2 Pb2+对凤眼莲叶、根NADH-GOGAT活性的影响

2.2.1 Pb2+对凤眼莲叶NADH-GOGAT活性的影响

研究结果如图3所示，胁迫6 h后，各处理组NADH-GOGAT活性均出现不同程度的下降，在0.25 mmol·L-1Pb2+处活性极显著下降，其活性比对照组低17.2%。胁迫6 d后,在0.5 mmol·L-1Pb2+处活性显著上升，其余各处理均未达到显著性影响水平。胁迫20 d后，各处理组NADH- GOGAT活性均出现不同程度下降，在1 mmol·L-1Pb2+处活性极显著下降，与对照组相比，活性被抑制了31.3%。胁迫60 d后，除0.25 mmol·L-1处NADH-GOGAT活性略微上升外，其余各组均极显著下降，活性最低点在2 mmol·L-1Pb2+处，与对照组相比，活性被抑制了67.2%。

另外，从图3可以看出，在同一处理浓度下随着胁迫时间的增加，叶片的NADH-GOGAT活性均出现不同程度上升，胁迫60 d活性上升极显著，0.1～2 mmol·L-1Pb2+胁迫使叶片的NADH-GOGAT活性与胁迫6h相比上升了31.1%～427%。

图3 Pb2+对凤眼莲叶片NADH-GOGAT活性的影响

（注：*表示差异达显著水平，<0.05；**表示差异达极显著水平，<0.01）

2.2.2 Pb2+对凤眼莲根NADH-GOGAT活性的影响

研究结果如图4所示，胁迫6h后，除0.1 mmol·L-1Pb2+处NADH-GOGAT活性显著下降，其余各处理均略微下降未达到显著性影响水平。胁迫6 d后, 除0.25 mmol·L-1处NADH-GOGAT活性显著下降，其余各处理均略微下降未达到显著性影响水平。胁迫20 d后，0.1～1 mmol·L-1Pb2+处理使根NADH-GOGAT活性升高，活性最高点在0.1 mmol·L-1Pb2+胁迫组，其活性比对照组高出91.1%，当Pb2+浓度达2 mmol·L-1Pb2+时，根NADH-GOGAT活性受抑制。胁迫60 d后，各处理组NADH-GOGAT活性均出现不同程度上升，活性最高点在2 mmol·L-1Pb2+胁迫组，其活性比对照组高出162%。

另外，从图4可以看出，在同一处理浓度下随着胁迫时间的增加，根的NADH-GOGAT活性未达到显著性影响水平，除2 mmol·L-1Pb2+处理组根的NADH-GOGAT活性波动稍微大点，其余各组根的NADH-GOGAT活性都能保持在一定的范围内波动。

图4 Pb2+对凤眼莲根NADH-GOGAT活性的影响

（注：*表示差异达显著水平，<0.05；**表示差异达极显著水平，<0.01）

3 结论与讨论

3.1 讨论

在植物的生长发育过程中，氮素的同化是一个十分重要的生理过程，无机氮必须同化为谷氨酰胺和谷氨酸等有机氮才能为植物体所吸收和利用。其中由GS与GOGAT构成的谷氨酸合酶循环是植物氮素同化的主要途径，高等植物体内 95%以上的NH4+通过GS/GOGAT(谷氨酰胺合成酶 /谷氨酸合成酶 )循环同化[7]，GS 和GOGAT的活性与植物体氮代谢能力密切相关。凤眼莲GS与GOGAT对1～2 mmol·L-1Pb2+污染胁迫的响应特点不尽相同，这可能与不同器官中GS/GOGAT循环的作用不尽相同有关。本试验结果与林清华等[8]研究NaCl对水稻谷氨酸合酶和谷氨酸脱氢酶的胁迫作用结果相似，凤眼莲和水稻一样表现为叶的GS活性远大于根的GS活性。研究结果体现凤眼莲根和叶的GS/GOGAT循环的作用有区别，以及提示凤眼莲叶和根的NH4+同化途径有所不同。因为在绿色组织中，GS/GOGAT循环的主要作用是同化光呼吸产生的NH4+以及硝酸盐在叶中还原产生的NH4+，在根中则是同化吸收到体内的NH4+以及硝酸盐被吸收后在根中还原产生的NH4+[8]。在各营养器官中，Pb2+处理对凤眼莲根的初级氮代谢影响最大，Pb2+污染使根同化NH4+的能力最为减弱，因此可能导致NH4+在根部的积累，氨浓度过高会对植物产生毒害，氨必须同化为体内的有机含氮化合物，才能避免对植物的危害。从氮素代谢的角度看，Pb2+毒可能为植物带来氨毒害。

凤眼莲根系对重金属具有很强的吸附和吸收作用。因此，在水体净化中可以选取像凤眼莲这样根系发达的水生植物，净化效果好，可应用于水体特别是一些封闭型水域如别墅区水系的治理中。同时，凤眼莲除了具有净化水体的作用外，在开花季节还可增添水体景观效果，只要适时捞取，便不会堵塞水体及河道。

3.2 结论

GS与GOGAT在凤眼莲的根、叶中均有分布，无论有无Pb2+污染存在，凤眼莲的根、叶的GS活性大于NADH- GOGAT活性，且GS活性和NADH-GOGAT活性均表现为叶＞根。 6h、6d、20d的 0.1～2 mmol·L-1Pb2+胁迫均会使根和叶的GS活性降低，但在Pb2+胁迫60 d后，各处理浓度GS活性均出现不同程度的应激上升，凤眼莲叶片GOGAT活性在Pb2+暴露60 d后极显著上升。

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李裕红。