芦笋粗多糖蛋白质脱除工艺研究

彭友舜，黄云祥，郑旭静，范海华，张运英

（1.河北科技师范学院，河北秦皇岛066000；2.河北省芦笋工程技术研究中心，河北秦皇岛066000；3.秦皇岛长胜农业科技发展有限公司，河北秦皇岛066000）

芦笋（Asparagus officinalis），学名石刁柏，又名龙须菜、文山竹等，是百合科天门冬属多年生宿根性草本植物。在欧洲其消费量仅次于番茄、青刀豆、蘑菇和豇豆，国际市场上被称为“蔬菜之王”。芦笋中含有游离氨基酸、维生素、微量元素（锌、铜、锰、硒等）等多种营养成分，以及皂苷、多糖、黄酮等药用成分[1-2]。其中芦笋多糖具有抗肿瘤、抗衰老、抗疲劳、降血脂、保肝解毒、免疫调节等多种生理活性[3-4]。有关芦笋多糖的研究在食品、医药等领域已成为新的热点，并显示出越来越广阔的应用前景。

植物中多含有蛋白质，利用植物提取的多糖中因蛋白质等物质常常影响植物多糖的纯度，导致其生理活性出现较大差异[5]。脱除蛋白质方法及报道很多，应用于不同原料的效果均有所不同，因此，芦笋多糖脱除蛋白质方面的研究具有实际应用意义。

除蛋白是多糖分离纯化过程中的首要和关键环节。常用的除蛋白方法有Sevage法、三氯乙酸-正丁醇法等。本实验受秦皇岛长胜农业科技发展有限公司的委托，研究芦笋多糖脱除蛋白工艺，以期为多糖生产过程中的纯化工序提供适宜的脱蛋白方法及工艺参数。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

芦笋粗多糖 秦皇岛长胜农业科技发展有限公司（多糖含量83.8%，蛋白质含量5.3%）；牛血清蛋白CBBG250 西安周鼎国生物技术有限责任公司；考马斯亮蓝G-250 国药集团化学试剂有限公司；D-无水葡萄糖 中国药品生物制品检定所，批号为110833-200503；其余试剂 均为分析纯。

UV-2401PC型紫外可见分光光度计 日本岛津公司；HZQ-QG型恒温振荡器 哈尔滨东联电子技术开发有限公司；KQ-200KDE型高功率数控超声波清洗器 昆山市超声波仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 多糖含量的测定 按苯酚-硫酸法测定多糖含量[6]。按下式计算多糖保留率：

式中：X1—多糖保留率，%；C0—脱蛋白前溶液中的多糖浓度，单位为mg/mL；Ct—脱蛋白后溶液中的多糖浓度，单位为mg/mL。

1.2.2 蛋白质含量的测定 按考马斯亮蓝法测定蛋白质含量[7]，按下式计算蛋白质脱除率：

式中：X2—蛋白脱除率，单位为%；C0′—脱蛋白前溶液中的蛋白质浓度，单位为mg/mL；Ct′—脱蛋白后溶液中的蛋白质浓度，单位为mg/mL。

1.2.3 脱蛋白方法 称取8.0g芦笋多糖粉末，加蒸馏水溶解定容至1000mL，即为8mg/mL的芦笋多糖母液。

1.2.3.1 Sevage法 设置Sevage试剂与样液体积比、氯仿与正丁醇体积比、振荡时间、静置时间以及除蛋白次数5个因素进行单因素实验。在单因素实验的基础上，按最优脱蛋白次数3次进行均匀设计实验，设置Sevage试剂与样液体积比（x1）、氯仿与正丁醇体积比（x2）、振摇时间（x3）和静置时间（x4）4个因素进行均匀设计实验，以综合指数为考察指标，选用均匀设计表进行均匀设计实验。实验因素水平设计见表1。

1.2.3.2 三氯乙酸-正丁醇法 设置三氯乙酸溶液与正丁醇的体积比、多糖溶液与三氯乙酸-正丁醇溶液的体积比、振荡时间、静置时间及脱蛋白次数5个因素进行单因素实验。在单因素实验的基础上，按最优脱蛋白次数3次进行均匀设计实验，设置三氯乙酸与正丁醇体积比（x1）、样液与三氯乙酸-正丁醇试剂体积比（x2）、振荡时间（x3）、静置时间（x4）4个因素进行均匀设计实验，以综合指数为考察指标，选用均匀设计表进行均匀设计实验。实验因素水平设计见表2。

1.3 数据处理

表1 Sevage法均匀设计实验的因素水平表Table 1 Table of factors and levels for Sevage method uniform design experiment

表2 三氯乙酸-正丁醇法均匀设计实验因素水平表Table 2 Table of factors and levels for trichloroacetic acid n-butanol method uniform design experiment

1.3.1 综合指数的确定 工业化生产需要综合考虑产品产量和产品品质，对不同的产品需求，这两个因素各有所侧重。根据长胜农业科技发展有限公司所生产产品的使用方向，确定多糖保留率、蛋白质脱除率两个因素并重的原则。

综合指数计算综合指数=多糖保留率×50%+蛋白质脱除率×50%

1.3.2 数据处理方法 所有实验均重复三次，图表中实验数据以平均值和标准偏差（M±SD）表示，使用Data Processing System（DPS V6.55）作图及进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 多糖含量的标准曲线

以葡萄糖浓度（x）为横坐标、吸光度（y）为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程：y=2.8860x-0.0537，R2=0.9986，在葡萄糖浓度0.10～0.30mg/mL范围内线性关系良好。

2.2 蛋白质含量的标准曲线

以牛血清蛋白浓度（x）为横坐标、吸光度（y）为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程：y=6.325x-0.1104，R2=0.9988，在蛋白质浓度0.07～0.15mg/mL范围内线性关系良好。

2.3 Sevage均匀设计实验

根据表1，通过DPS V6.55软件进行均匀设计，实验方案及结果见表3。

以综合指数为目标函数，对实验结果进行偏最小二乘回归建模，采用偏最小二乘二次多项式回归方法进行分析，其模型如下：

Y=6.4503571+15.966194x1+15.198930x2+1.451433x3+1.459576x4-3.576026x12-1.791135x22-0.021525x32-0.021272x42+0.067455x1x2-0.047917x1x3+0.012389x1x4-0.064351x2x3-0.067252x2x4+0.007941x3x4，R2=0.9783。

各因变量与各自变量标准回归系数关系见表4。

由表4中x1、x2、x3、x4所对应的Y值可知，四个因素对Sevage法脱除芦笋多糖中蛋白质的综合指标影响大小顺序为：x4＞x1＞x3＞x2，即静置时间＞Sevage试剂与样液体积比＞振摇时间＞氯仿与正丁醇体积比。

表3 Sevage法均匀设计实验方案及结果Table 3 Scheme and results of Sevage method uniform design experiment

表4 Sevage法标准回归系数表Table 4 Table of standard regression coefficients on Sevage method

对模型求解得到Sevage法脱除芦笋多糖蛋白质最佳条件，见表5。

表5 Sevage法最优因素组合表Table 5 Table of optimal factor combination on Sevage method

在Sevage试剂与样液体积比1∶2、氯仿与正丁醇体积比3∶1、振荡时间34min、静置时间36min的条件下，进行验证实验，重复三次，得出多糖保留率为85.92%±0.15%，蛋白质去除率为42.68%±0.10%，平均综合指数为96.89%±0.26%。实验结果与模型预测的目标函数误差为0.08%，认定该模型有效。

2.4 三氯乙酸-正丁醇均匀设计实验

根据表2，通过DPS V6.55软件进行均匀设计，实验方案及结果见表6。

以综合指数为目标函数，对实验结果进行偏最小二乘回归建模，采用偏最小二乘二次多项式回归方法进行分析，其模型如下：

y=-3.0560471+1.460256x1+21.401348x2+1.512811x3+1.130809x4-0.050230x12-9.314793x22-0.015192x32-0.004408x42+0.234144x1x2+0.000346x1x3+0.001174x1x4-0.049095x2x3-0.009058x2x4-0.009670x3x4，R2=0.9569。

由表7中x1、x2、x3、x4所对应的y值可知，采用三氯乙酸-正丁醇法脱除芦笋多糖中的蛋白质，各因素影响的主次顺序为：x4＞x3＞x2＞x1，即静置时间＞振荡时间＞样液与三氯乙酸-正丁醇体积比＞三氯乙酸溶液与正丁醇的体积比。

表6 三氯乙酸-正丁醇法均匀设计实验方案及结果Table 6 Scheme and results of trichloroacetic acid n-butanol method uniform design experiment

表7 三氯乙酸-正丁醇法标准回归系数表Table7 Table of standard regression coefficients on trichloroacetic acid n-butanol method uniform design experiment

对模型求解得到三氯乙酸-正丁醇法脱除芦笋多糖蛋白质最佳条件，见表8。

表8 三氯乙酸-正丁醇法最优因素组合表Table 8 Table of optimal factor combination on trichloroacetic acid n-butanol method

设定三氯乙酸-正丁醇试剂中三氯乙酸溶液与正丁醇的体积比1∶20、三氯乙酸-正丁醇与多糖溶液的体积比1∶2、振荡时间39min、静置时间60min的条件下，进行验证实验，重复三次，得出多糖保留率为66.21%±0.11%，蛋白质去除率为91.49%±0.30%，平均综合指数为98.48%±0.32%。实验结果与模型预测的目标函数值误差为0.08%，认定该模型有效。

3 结论

Sevage法为：在Sevage试剂与样液体积比1∶2、氯仿与正丁醇体积比3∶1、振荡时间34min、静置时间36min工艺条件下，多糖保留率为85.92%±0.15%，蛋白质去除率为42.68%±0.10%，平均综合指数为96.89%±0.26%。三氯乙酸-正丁醇法为：在三氯乙酸溶液与正丁醇的体积比1∶20、三氯乙酸-正丁醇与多糖溶液的体积比1∶2、振荡时间39min、静置时间60min工艺条件下，多糖保留率为66.21%±0.11%，蛋白质去除率为91.49%±0.30%，平均综合指数为98.48%±0.32%。

综上可知，三氯乙酸-正丁醇法脱除芦笋多糖蛋白质的效果优于Sevage法。

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