超声波辅助提取蓝莓果渣中花色苷的条件研究

李金星，胡志和，2，*，马立志，雷 颖，经 典

（1.天津商业大学生物技术与食品科学学院，天津300134；2.天津市食品生物技术重点实验室，天津300134；3.贵阳学院食品与制药工程学院，贵州贵阳550005）

蓝莓（blueberry）又称越橘、蓝浆果，杜鹃花科（Ericaceae）越桔属（Vaccinium spp.）多年生落叶或常绿灌木，果实为浆果，近圆形，呈蓝色，酸甜适度，果肉细腻，皮薄籽小[1-2]。蓝莓是越橘属植物中营养成分最丰富的种类，除含常规的有机酸、糖以外，还富含的多种维生素、超氧化物歧化酶（SOD）、不饱和脂肪酸、矿物质等成分，以及花色苷、黄酮、尼克酸等特殊成分[3]。经研究发现，蓝莓不仅具有极高的营养价值，还具有多种生理功能[4-7]。因此，被联合国粮农组织列为人类五大健康食品之一[8]。蓝莓除了鲜食之外，一般加工成果浆﹑果汁或浓缩汁。在蓝莓加工过程中，很多生物活性成分残留在皮渣中，尤其是花色苷的含量特别高[9]。

花色苷是一类广泛存在于植物中的水溶性天然色素，属黄酮类化合物[10]。与合成色素相比，具有安全性高、资源丰富且具有一定的营养和药理作用等优点[11]。近年来，随着人们对食品安全和自身健康的重视，花色苷已经越来越受到消费者和研究者的关注。

超声波辅助技术是一项新型的天然产物辅助溶剂提取技术，它利用超声波的机械作用、空化作用、热效应等加速提取物的有效溶出，缩短了提取时间，提高了提取效率，同时避免了高温对提取物质的影响[12-13]。本研究以蓝莓果渣为原料，同时应用超声波对花色苷进行辅助提取，以期为充分利用蓝莓资源，提高花色苷的提取效率提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

蓝莓冻果（北陆） 北京东方夏都树莓科技发展有限公司；果胶酶（纯度＞98%，40000μ/g） 天津昊斯生物科技有限公司；甲醇、乙醇、丙酮、氯化钾、乙酸钠、盐酸 均为分析纯，天津昊斯生物技术有限公司。

KQ－500DE型数控超声波清洗器（频率40kHz）昆山市超声仪器有限公司；HWS24型电热恒温水浴锅 上海一恒科技有限公司；6202型高速粉碎机 北京环亚天元机械技术有限公司；FD－2型冷冻干燥机 北京博医康实验仪器有限公司；L535－1型低速离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司；TU－1810型紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司。

1.2 实验方法

1.2.1 原料预处理 称取一定量蓝莓进行解冻破碎，按照果胶酶添加量为质量分数0.06%、酶解温度为35℃、酶解时间为2.5h处理后进行榨汁，100℃灭酶30min后离心（4000r/min）10min，取榨汁后的蓝莓果渣，冷冻干燥后烘干至恒重，粉碎成粉末，备用。

1.2.2 蓝莓果渣花色苷最大吸收波长的测定 准确称取1g蓝莓果渣粉末，以体积分数为60%的酸性乙醇（HCl体积分数为1%；pH=1.5）为溶剂，料液比为1∶50g/mL，40℃下超声波功率500W提取40min，提取一次，将提取液过滤，取滤液稀释20倍，测定蓝莓果渣花色苷的最大吸收波长。

1.2.3 花色苷提取量的计算 将蓝莓果渣粉末进行提取后，测定提取液的吸光值，参考杨兆艳[14]的公式并进行改良，计算花色苷提取量。

花色苷提取量（mg/g）=（A/εL）×MW×DF×V/Wt

式中：A─吸光度，A=（A520nmpH1.0－A700nmpH1.0）－（A520nmpH4.5－A700nmpH4.5）；ε─矢车菊花素－3－葡萄糖苷的消光系数，26900；L─光程，1cm；MW─矢车菊花素－3－葡萄糖苷的分子量，449.2；DF─稀释因子；V─最终体积，mL；Wt─产品重量，mg。

1.2.4 提取溶剂的选择 准确称取4份1g的果渣粉末，分别以体积分数为60%的酸性甲醇（HCl体积分数为1%；pH=1.5）、酸性乙醇（HCl体积分数为1%；pH=1.5）、酸性丙酮（HCl体积分数为1%；pH=1.5）、酸水（HCl体积分数为1%；pH=1.5）为溶剂，按料液比1∶50g/mL，提取温度40℃，超声波功率500W，提取时间40min进行提取，提取一次，将提取液过滤，测定花色苷提取量，确定最佳提取溶剂。

1.2.5 单因素实验

1.2.5.1 提取溶剂体积分数对花色苷提取量的影响分别准确称取5份1g的果渣粉末，选取料液比为1∶50g/mL，超声波功率为500W，提取温度为40℃，提取时间为40min，分别采用体积分数为40%、50%、60%、70%、80%的酸性乙醇（HCl体积分数为1%；pH=1.5）为提取溶剂进行提取。提取一次，将提取液过滤，测定花色苷提取量，确定较好的提取溶剂体积分数。

1.2.5.2 料液比对花色苷提取量的影响 分别准确称取5份1g的果渣粉末，选取体积分数为60%的酸性乙醇（HCl体积分数为1%；pH=1.5），超声波功率为500W，温度为40℃，提取时间为40min，分别采用1∶10、1∶30、1∶50、1∶70、1∶90g/mL为料液比进行提取。提取一次，将提取液过滤，测定花色苷提取量，确定较好的料液比。

1.2.5.3 提取温度对花色苷提取量的影响 分别准确称取5份1g的果渣粉末，选取体积分数为60%的酸性乙醇（HCl体积分数为1%；pH=1.5），料液比为1∶50g/mL，超声波功率为500W，提取时间为40min，分别采用20、30、40、50、60℃为提取温度进行提取。提取一次，将提取液过滤，测定花色苷提取量，确定较好的提取温度。

1.2.5.4 提取时间对花色苷提取量的影响 分别准确称取6份1g的果渣粉末，选取体积分数为60%的酸性乙醇（HCl体积分数为1%；pH=1.5），料液比为1∶50g/mL，超声波功率为500W，温度为40℃，分别采用10、20、30、40、50、60min为提取时间进行提取，提取一次。将提取液过滤，测定花色苷提取量，确定较好的提取时间。

1.2.5.5 提取功率对花色苷提取量的影响 分别准确称取7份1g的果渣粉末，选取体积分数为60%的酸性乙醇（HCl体积分数为1%；pH=1.5），料液比为1∶50g/mL，温度为40℃，提取时间为40min，分别采用200、250、300、350、400、450、500W为提取功率进行提取。提取一次，将提取液过滤，测定花色苷提取量，确定较好的提取功率。

1.2.6 最佳提取条件的确定 结合单因素实验结果，选定提取溶剂体积分数、料液比、提取温度、提取时间、提取功率为主要影响因素，设计5因素4水平正交实验进行优化，每组实验提取一次，以花色苷提取量为考察指标，确定超声波辅助提取蓝莓果渣中花色苷的最佳工艺条件。

1.2.7 最佳提取次数的确定 在单因素实验和正交实验确定的最佳提取条件下，对蓝莓果渣粉进行提取，过滤得到滤液I，滤渣在最佳提取条件下进行二次提取，过滤得滤液Ⅱ，采取相同的操作分别得滤液Ⅲ，Ⅳ…n…N，以花色苷的提取量作为考察指标。

1.2.8 与酸性乙醇浸提法的比较实验 准确称取1g蓝莓果渣粉末，选取超声波功率0W，提取时间120min，其他条件采用超声波辅助提取确定的最佳条件进行提取，将提取液过滤，测定花色苷提取量。与超声波辅助提取进行比较。

表1 L16（45）因素水平表Table 1Factor－level design L16（45）

1.3 数据处理

每组实验重复三次，分别平行取样，结果以平均值计算。用Microsoft Excel 2003软件对实验结果进行处理。

2 结果与分析

2.1 蓝莓果渣花色苷的紫外可见吸收光谱

图1 蓝莓果渣提取液的紫外可见吸收光谱图Fig.1 UV-visible absorption spectra of blueberry pomace extracts

由于花色苷所带的基团不同，可能会有以下几个特征吸收峰：一个位于可见光区的500～540nm之间，另一个位于紫外光区275nm附近；另外，如果花色苷存在酰基化，则在紫外区300～330nm处也存在特征吸收峰[15]。由图1可见，蓝莓果渣提取液分别在520、330、以及280nm处出现吸收峰，这与花色苷的特征吸收峰相符，表明蓝莓果渣提取液中含有花色苷类物质。提取液在330nm处出现吸收峰，说明花色苷酰基化比较多，芳香基团多。

2.2 提取溶剂的选择

花色苷是水溶性多酚类物质，可溶于水、甲醇、乙醇等极性溶剂中。花色苷在弱酸性条件下稳定，中性和弱碱性条件下不稳定，因此，通常选用酸性溶剂进行提取。由图2可知，酸性乙醇提取效果最好，花色苷提取量为8.42mg/g，酸性甲醇次之，酸性水溶液对蓝莓果渣的提取效果最差，提取量仅为5.78mg/g。因此本实验选择酸性乙醇作为提取溶剂。

图2 不同提取溶剂对花色苷提取量的影响Fig.2 Effect of different extraction solvents on the yield of anthocyanins

2.3 酸性乙醇为溶剂提取皮渣中花色苷的条件优化

2.3.1 乙醇体积分数对花色苷提取量的影响 由图3可知，随着乙醇体积分数的增加，花色苷的提取量逐渐升高，在乙醇体积分数达到60%时达到最大，花色苷提取量为8.55mg/g，但是乙醇体积分数继续增加，花色苷的提取量反而逐渐降低。这可能是因为在乙醇体积分数较低的体系中，一些水溶性好的物质影响了花色苷的溶出，导致提取效果差；在乙醇体积分数较高的体系中，花色苷能较好地溶解，而其他物质则不易溶出，因此花色苷提取效果较好。但是，乙醇体积分数过高，脂溶性成分溶出增加，造成提取效果变差[16]。因此选择60%为提取最佳乙醇体积分数。

图3 乙醇体积分数对花色苷提取量的影响Fig.3 Effect of ethanol concentration on the yield of anthocyanins

2.3.2 料液比对花色苷提取量的影响 由图4可知，随着料液比的增大，花色苷提取量逐渐增加，当料液比达到1∶50g/mL时提取量达到最大，花色苷提取量为8.42mg/g，料液比继续增加，提取量变化不明显。这可能是因为料液比的增加能增大固液两相花色苷的浓度差，有利于花色苷的溶出，从而提高提取量[17]。因此选择1∶50g/mL为提取最佳料液比。

图4 料液比对花色苷提取量的影响Fig.4 Effect of solid-liquid ratio on the yield of anthocyanins

2.3.3 提取温度对花色苷提取量的影响 由图5可知，随着提取温度的升高，花色苷提取量逐渐增加，当温度达到40℃时达到最大，花色苷提取量为8.68mg/g，温度继续增加，花色苷的提取量反而下降。这可能是因为提取温度的升高有利于花色苷的溶出，提取量增加。但温度过高，可能导致花色苷降解或结构变化，使提取量或检测值降低[18]。因此选择40℃为提取最佳温度。

图5 提取温度对花色苷提取量的影响Fig.5 Effect of extraction temperature on the yield of anthocyanins

2.3.4 提取时间对花色苷提取量的影响 由图6可知，随着提取时间的延长，花色苷的提取量逐渐增加，提取时间为40min时达到最大，花色苷提取量为8.58mg/g；提取时间继续增加，花色苷的提取量反而降低。这可能是因为随着提取时间的延长，花色苷逐渐溶出，提取量增加；提取时间继续延长，可能会影响花色苷的稳定性，使其部分降解，提取量下降[19]。因此选择40min为提取最佳时间。

图6 提取时间对花色苷提取量的影响Fig.6 Effect of extraction time on the yield of anthocyanins

2.3.5 提取功率对花色苷提取量的影响 由图7可知，随着提取功率的增加，花色苷的提取量逐渐增加，功率达到350W左右时提取量达到最大，花色苷提取量为8.73mg/g，之后提取功率继续增加，花色苷提取量逐渐减少。这可能是因为超声波的物理剪切作用和空化作用可以在短时间内破坏蓝莓果渣的细胞结构，使花色苷迅速有效溶出，使提取量增加。但是提取功率过高，会破坏花色苷的稳定性，使花色苷提取量减少[20]。

图7 提取功率对花色苷提取量的影响Fig.7 Effect of extraction power on the yield of anthocyanins

2.3.6 最佳提取条件的确定 根据上述单因素实验，选取提取溶剂体积分数、料液比、提取温度、提取时间、提取功率，按照正交表L16（45）进行正交优化实验，结果见表2。

表2 L16（45）正交实验结果Table 2 The results of orthogonal experiment

由表2可知，16组实验中超声波辅助提取花色苷的最优条件组合为A2B3C4D1E2，即超声波功率为350W，提取温度为45℃，提取时间为50min，料液比为1∶45g/mL，乙醇体积分数为60%，提取一次。在此条件下花色苷的提取量为（8.8±0.05）mg/g。

极差R值分析结果表明，各因素对花色苷提取量的影响次序为E＞D＞B＞A＞C，即乙醇体积分数＞料液比＞提取温度＞超声波功率＞提取时间。分析k值可知，最优组合为A2B3C4D3E2，即超声波功率为350W，提取温度为45℃，提取时间为50min，料液比为1∶55g/mL，乙醇体积分数为60%，提取一次。由于此组合未出现在正交实验的组合之内，按此条件进行验证实验，重复三次，花色苷提取量为（9.01±0.03）mg/g，优于直观分析的最佳组合，说明分析结果正确可靠。

2.4 提取次数的确定

按照正交实验优化的条件对蓝莓果渣进行多次提取，结果如图8所示，提取两次的花色苷总量（9.91±0.05mg/g）与提取三次的花色苷总量（10.09±0.03mg/g）相差甚小，且提取两次的花色苷含量基本达到稳定，综合提取成本、提取量和提取效率等因素，从蓝莓果渣中提取花色苷时提取2次即可。

图8 提取次数对花色苷提取量的影响Fig.8 Effect of Extraction times on the yield of anthocyanin

2.5 与酸性乙醇浸提法的比较实验

按1.2.8对蓝莓果渣进行酸性乙醇浸提，在此条件下花色苷的提取量为（8.34±0.03）mg/g。在提取温度、乙醇浓度、物料比、提取次数等条件相同的情况下，超声波辅助提取花色苷的量为（9.91±0.05）mg/g，比酸性乙醇浸提法所得到的花色苷含量提高18.8%。与酸性乙醇浸提法相比，超声波辅助提取能大大缩短提取时间，提高提取量。

3 结论

通过单因素实验和正交实验，得出各因素对花色苷提取量的影响次序：乙醇体积分数＞料液比＞提取温度＞超声波功率＞提取时间。

超声波辅助提取花色苷的最优工艺条件为：超声波功率350W，提取温度45℃，提取时间50min，料液比1∶55g/mL，乙醇（pH=1.5）体积分数60%，提取2次，在此条件下花色苷提取量为（9.91±0.05）mg/g。酸性乙醇浸提法采用超声波功率0W，提取时间120min，其他条件采用超声波辅助提取确定的最佳条件对花色苷进行提取，花色苷提取量为（8.34±0.03）mg/g。

综上可知，与酸性乙醇浸提法相比，超声波辅助提取蓝莓果渣中的花色苷，提取时间短，提取量大，提高了提取效率。

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