柱层析循环法联合提取脐橙皮中橙皮苷与多糖的工艺研究

韩寒冰，周 天，刘杰凤，马 超，王 颖

（广东石油化工学院化学与生命科学学院，广东茂名525000）

脐橙是芸香科柑橘属甜橙类（Citrussinensis L.Osbeck）中的一个栽培品种，营养丰富，含有人体所必需的多种营养成分。由于脐橙果皮中含有果胶、类黄酮、香精油、色素和多糖等多种有效成分[1-2]。随着种植面积和规模的迅速扩大，占脐橙果重20%的果皮也成为具有巨大开发潜力的资源。其中橙皮苷（Hesperidin，C28H34O15）是脐橙果皮中最主要的类黄酮，药理研究表明，橙皮苷具有抗氧化、抗炎镇痛、免疫调节和抗肿瘤等作用[3-4]。多糖具有清除自由基和抗氧化作用，在抗肿瘤、抗肝炎、抗心血管和抗衰老等方面有独特的生物活性，而且对细胞毒性极低[5-7]，因此具有极高的药学价值。

近年来，对类黄酮物质和多糖的提取常用索氏提取法、超声波和微波辅助提取法[6-9]，但以上方法都普遍存在工艺都比较复杂、提取时间长、溶剂用量大、分离纯化程序复杂等缺陷。另外，这些方法都只孤立地考虑提取其中的一种功能成分，必定造成材料和溶剂的浪费。随着现代科学技术的发展，柱层析循环法已广泛应用于天然植物有效成分的提取和分离，具有溶剂消耗量少、提取效率高、处理时间短、操作简便等优点[10-12]。本研究采用柱层析循环法对脐橙皮的橙皮苷和多糖进行联合提取，确定影响效果的主要因素和分离优化工艺条件，为有效地提取脐橙皮的橙皮苷和多糖开辟了新途径。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

脐橙 从本地商场购买江西产新鲜脐橙，剥下果皮剪成黄豆粒大小，50℃烘箱中烘至恒重，材料经粉碎，过40目筛得到等于或小于40目（或≤380μm）的粉末作提取用；橙皮苷标准品 中国药品生物制品检定所提供（No.110722-200810，纯度≥98%）；HPLC用甲醇 色谱级，购自美国的Fisher Scientific公司；其他试剂 分析纯。

LC-20A型高效液相色谱仪、LC-20AT型UV检测器 日本岛津公司；DL-6000型低速冷冻大容量离心机 上海安亭科学仪器厂；UV-2550型紫外-可见光分光光度计 日本岛津公司；KQ5200B型超声波清洗器 江苏省昆仑山市超声仪器有限公司；XYFD-8L型冷冻干燥机 上海欣谕仪器有限公司。

1.2 橙皮苷和多糖含量测定

1.2.1 HPLC法测定橙皮苷含量 色谱柱为YMC ODS柱（250mm×4.6mm，5μm），流动相A为甲醇，B为1%冰醋酸水溶液，A∶B=35∶65（v/v）。流速1.0mL/min，柱温40℃，检测波长283nm，进样量10μL。

标准曲线的制作：准确称取橙皮苷对照品若干，用甲醇溶解配制成1mg/mL的橙皮苷对照品溶液，用40%乙醇稀释成一系列的浓度梯度：25、50、75、100、125、150μg/mL，分别进行液相色谱分析，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

1.2.2 苯酚硫酸法测定多糖含量 测定多糖用苯酚硫酸法[13]，以葡萄糖为对照品，用纯水配成梯度浓度分别为10、20、30、40、50、60μg/mL的葡萄糖标准工作液。以葡萄糖浓度为横坐标，相应的吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

1.3 联合提取橙皮苷和多糖的工艺条件

1.3.1 选择溶剂配比 把乙醇和水配制成体积比分别为10∶0、8∶2、6∶4、4∶6、2∶8，0∶10。称取脐橙皮粉末0.5g 6份，分别加入相应配比的溶剂5mL，室温内摇床振荡（200r/min）1h，6000r/min低温离心10min，分别检测橙皮苷和多糖的含量。

1.3.2 确定吸涨率和浸泡时间 称取0.5g脐橙皮粉末12份，并列2组，分别加入40%乙醇或水5mL，室温内摇床振荡（200r/min），浸泡时间分别为0.5、1、2、3、4、5h，到时取出，6000r/min低温离心10min，分别测定上清液体积，用总体积（5mL）减去上清液体积，计算1g材料吸收溶剂量（mL），即吸涨率；分别测定上清液中橙皮苷或多糖的含量，确定目标物质在相应溶剂中溶解达到平衡的浸泡时间。

1.4 柱层析法提取橙皮苷和多糖

1.4.1 柱层析法分别提取橙皮苷和多糖 选取直径为1.5cm的玻璃层析柱，脐橙皮粉末5g，40%乙醇（体积分数）湿样上柱，保持乙醇溶液没过样品，室温静置2h，以吸涨体积（25mL）为一个收集单位（即一份），以每小时收集一份的流速进行收集，共收集3份，残渣经超声1h，抽滤再得到一份提取液，分别测定各份橙皮苷的含量。同样方法，用纯水上样，收集3份水提取液和1份残渣提取液（各35mL），分别测定各份多糖的含量。

1.4.2 柱层析循环法联合提取橙皮苷和多糖 橙皮苷与多糖的提取连续进行，首先提取橙皮苷，方法与分别提取橙皮苷的相同，不同的是当收集完第1份40%乙醇洗脱液（25mL）后，提取液换为纯水，再收集第2份洗脱液（25mL），相当把柱内的乙醇溶液收集完毕。继续添加水，连续收集2份水洗脱液（各35mL）。只保留各提取液中的第1份，第2份提取液由于浓度较低，均作为下一轮的第1份提取液，如此重复循环，共用4根层析柱进行。分别合并各轮中第1份醇和水提取液，测定橙皮苷和多糖含量，计算各轮第1份的提取率。

1.5 橙皮苷与多糖的分离

实验放大100倍，每份脐橙皮粉500g，选择4根直径为8cm的层析柱，作放大循环实验，方法与1.4.2项下相同。合并4根柱第1份醇提取液10L和水提取液14L，共24L。减压浓缩为2L，加8L无水乙醇，充分摇匀，冰箱4℃静置过夜，6000r/min低温离心10min，倾出上清液，沉淀再用2L水溶解，加8L无水乙醇，重复以上实验，合并上清液。橙皮苷溶在上清液中，沉淀为粗多糖，分别测定橙皮苷和多糖的含量。

1.6 橙皮苷和多糖的纯化

将1.5项下中上清液减压浓缩到1L，回收乙醇，浓缩液中橙皮苷析出，低温高速离心，倾去上清液，沉淀用1L水洗，静置离心，倾去上清液，重复水洗2次，沉淀为橙皮苷的粗产品。测定粗产品中橙皮苷的含量，并计算得率。将粗产品充分溶于热水中，置冰箱4℃静置1周，经布氏漏斗抽滤，去掉水液和杂质，用纯水反复冲洗滤纸上的结晶，抽干后连同滤纸置烘箱中烘干，待产品与滤纸分离后，测定产品的总重量及橙皮苷的含量，计算结晶的纯度和得率。结晶产品重结晶，计算重结晶的纯度和得率。

将粗多糖重溶于水中，80%乙醇沉淀，冰箱4℃静置过夜，6000r/min低温离心10min，得沉淀再重复沉淀一次，沉淀经冷冻干燥（-50℃，20Pa）得多糖粉末，经苯酚硫酸法测定多糖含量，并计算多糖的纯度。

2 结果与分析

2.1 提取物橙皮苷HPLC分析和标准曲线

脐橙皮中的橙皮苷含量较高，橙皮苷在283nm有最大的吸收峰[14]，HPLC色谱图见图1，图1中样品主峰与对照品橙皮苷的相对保留时间均为14.979min，峰形一致，因而可用橙皮苷的标准曲线来测定样品中的橙皮苷含量。

图1 橙皮苷HPLC色谱图Fig.1 Analysis of hesperidin by HPLC

图2是橙皮苷和多糖的标准曲线，橙皮苷含量的回归方程为：y=1706x-1801（R2=0.9998），说明线性关系良好，线性范围在25～150μg/mL之间。多糖含量的回归方程为y=0.0101x-0.0086（R2=0.9991），线性范围在10～60μg/mL之间。

图2 橙皮苷标准曲线和多糖标准曲线Fig.2 Standard solution curves of hesperidin and polysaccharides

2.2 提取工艺条件

橙皮苷易溶于乙醇，难溶于水，从图3（A）可以看出，醇水比为4∶6时的提取率最高，多糖在醇的溶解性很低，易溶于水，从图3（B）可以看出，纯水的多糖提取率最高，随着醇水比值的增大，多糖提取率下降。醇水溶液有效地提取橙皮苷的同时，也把部分多糖提取出来，以水的提取率为100%来计算，醇水比为4∶6溶液的多糖提取率为16.6%。另一方面，在水有效提取多糖的同时，也把部分橙皮苷提取出来，大约相当醇水最大提取率的1/3。因此，在柱层析法联合提取过程中，首先采用醇水比为4∶6的乙醇溶液为橙皮苷的洗脱液，再以纯水作为多糖的洗脱液，对层析柱中的材料进行连续洗脱，能够高效地把橙皮苷和多糖提取出来。

图3 醇水比例对橙皮苷和多糖提取效率的影响Fig.3 Affect of proportion of ethanol and water on the extraction rate of hesperidin and polysaccharides

材料对不同的溶剂的吸收性能有所不同，从图4可以看出，材料浸泡1h后吸收量均达到最大。乙醇溶液和水的吸涨率分别接近5倍和7倍（mL/g），因此，乙醇溶液和水提取液分别以5倍体积和7倍体积为1份作一个收集单位。

图4 40%乙醇和水的吸涨率Fig.4 Imbibed rate of 40%ethanol and water

经过不同时间的浸泡，溶液中橙皮苷或多糖的含量变化见图5，在2h橙皮苷和多糖的含量均达到最大，增加浸泡时间，含量也不再增大，说明浸泡2h后，目标成分在相应的溶剂中已充分溶解达到平衡。因此，可以确定材料在层析柱中浸泡时间为2h。

图5 浸泡时间的测定Fig.5 Determination of soaking time

2.3 分别和联合循环提取橙皮苷和多糖的效率

图6 分别提取橙皮苷和多糖的提取率Fig.6 Extraction rate of hesperidin and polysaccharides by Independent

分别提取橙皮苷和多糖的提取率见图6，以3份提取液和残渣的含量总和看作是目标成分的总含量，无论是橙皮苷或多糖，第1份和第2份相加的提取率均超过99%，因此在收集洗脱液时，只需要收集第1、2份。

从图7中可看出，联合循环提取时，第一轮第一份橙皮苷和多糖的提取率分别为92.7%和90.2%，从第二轮开始，第一份的提取率均达99%以上。因此，每轮两成分的提取液均只需保留第一份作为分离纯化用，第二份作为下轮的提取液，如此循环，可减少溶剂量，而且得到的是浓度较大的提取液，大大地提高了提取效率。

图7 循环联合提取橙皮苷和多糖的提取率Fig.7 Extraction rate of hesperidin and polysaccharides by combined cycle

2.4 橙皮苷和多糖的分离纯化结果

通过循环提取，合并乙醇溶液和水提取液的第1份，浓缩后，用醇沉淀，一次性把两种成分分离开来，再作后续的纯化，结果见表1。

脐橙皮中橙皮苷和多糖的含量分别是4.85%和1.93%，循环提取率达到99%以上，醇沉分离得到的橙皮苷粗产品中橙皮苷含量为60.27%，多糖粗产品中多糖的含量为15.42%，得率分别是95.45%和97.58%。橙皮苷粗产品为暗灰色粉末，水中放冷结晶为淡黄色悬浮状，用纯水冲洗抽滤，烘干得白色带黄粉末，纯度92.56%，得率94.78%，第2次结晶得淡黄色结晶，纯度97.84%。粗多糖经过两次的水溶和醇沉，最终多糖纯度达到85.32%。

表1 橙皮苷和多糖的含量、纯度、提取率和回收率Table 1 Content，purity，extraction rate and recovery rate of hesperidin or polysaccharid

3 结论与讨论

橙皮苷的常用提取方法有乙醇提取法[15]、“碱提酸析”法[16]和水浸超声辅助法[8]等，醇提法和碱提法都可用超声强化提取过程。有关橙皮苷的结晶工艺的报道较少，各文献报道的最佳提取工艺条件也差别很大。荆瑞勇等[6]提取脐橙皮多糖时，料液比1∶40，提取时间3h，提取温度95℃，显然，提取温度高，时间长，多糖有效成分容易失活，提取液用量大，不利于多糖的分离和纯化。柱层析法原理是利用混合物中各组分物理化学性质上的差异（如分子形状、大小、极性、亲和力和分配系数等），使各组分以不同浓度分布在两相（固定相和流动相）中，并以不同速度移动，最终分离纯化各组分[17]。柱层析循环法的工艺简单，溶剂用量少，并可通过用不同极性的溶剂连续把橙皮苷和多糖提取出来。

本实验的结果表明，通过柱层析联合循环提取时，用5倍体积的40%乙醇和7倍体积的水就能把脐橙皮中99%以上的橙皮苷和多糖提取出来。如果分别用乙醇溶液和水提取橙皮苷和多糖时，两种洗脱液中均包含橙皮苷和多糖，需各自将两种成分分离开来，工艺繁杂，效率低，成本增加。柱层析循环法可避免分别分离纯化两种组分，而是在常温条件下，使用乙醇溶液和水连续对脐橙皮粉末洗脱，每轮两成分的提取液只需保留第1份作为分离纯化用，第2份作为下轮的洗脱液，如此循环，洗脱液合并，醇沉淀多糖，一次性把它们分离开来。因此，循环联合提取既节省大量溶剂，同时也减少后续的浓缩工序，成本低，功能成分损失少，效率高，是一个适合联合提取并分离橙皮苷和多糖的方法。

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