超高压处理对牛初乳中IgG活性的影响

任 杰，胡志和，吴子健，薛 璐

（天津市食品生物技术重点实验室，天津商业大学生物技术与食品科学学院，天津300134）

IgG是一类具有良好的免疫保护功能和生物活性物质的球蛋白，是牛初乳中最引人注目的功能因子，也是牛初乳中最重要的免疫因子[1-2]。在人类历史上，利用非免疫牛生产的初乳来预防和治疗人类疾病，已有几个世纪的历史。虽然IgG的含量在整个泌乳期分布非常不均衡[3]，但是在初乳中含量特别高，占免疫球蛋白总量的80%～90%[4-5]。医学和临床研究均表明，IgG是系统免疫的产物，主要由脾脏和淋巴结中的B细胞转化发展成的浆细胞产生并进入血液，然后通过乳腺组织中的主动转移机制到达牛乳之中[6]。通过初乳的传递，IgG可以使那些自身免疫系统尚未发育健全的新生仔畜免受外来疾病的侵袭，特别是对肠道疾病和肠道微生物的侵袭提供了局部保护作用[7-8]。相比于其他类的免疫球蛋白，IgG更易扩散到血管外的间隙内，因而在结合补体、增强免疫细胞吞噬病原微生物以及中和细菌毒素等方面能更加有效地发挥作用，抵抗外部的感染[9]。目前，作为一种生物活性蛋白质的IgG，常常被添加到乳制品中，以其含量为决定产品质量和价格的标准[10]；在不同加工处理工艺对产品营养价值影响的评价中，其含量又可作为活性蛋白质保留或损失程度的指标[11]；在大多数的牛初乳及具有免疫功能的乳制品开发和加工过程中，都会对其质量浓度进行检测[12-13]。

IgG的检测方法有多种，主要有分离层析法、电泳法、免疫学法和物理法等[14]，其中酶联免疫法检测牛初乳中的IgG活性，检测结果快速、准确，灵敏度高[15-16]。本实验从探讨牛初乳营养价值的角度出发，研究不同的超高压处理条件对牛初乳中IgG活性的影响，采用酶联免疫法对其进行检测，为牛初乳制品的研究和开发提供了科学参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

牛初乳（产犊48h内） 由天津市武清区德兴隆奶业有限公司提供；NaCl等生化试剂 分析纯级，天津市化学试剂批发公司；ELISA检测试剂盒 牛免疫球蛋白G（IgG）酶联免疫试剂盒，购自深圳慧嘉生物科技有限公司；试剂盒包括封板膜、密封袋、用纯化的抗原包被的ELISA反应板、标准品、标准品稀释液、样品稀释液、辣根过氧化物酶标记的抗原、显色剂A液、显色剂B液、终止液、浓缩洗涤液。

HPP.L3-600/0.6超高压设备 天津市华泰森淼生物工程技术有限公司；RT-6000酶标分析仪 深圳雷杜生命科学股份有限公司；VELP漩涡振荡器 德祥科技有限公司；循环水式多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司；塑料薄膜封口机 浙江江南实业有限公司。

1.2 样品的超高压处理

量取5mL左右的生鲜牛初乳装于聚乙烯塑料袋内，真空密封后进行超高压处理，将处理后的牛初乳稀释一定倍数后待用，检测样品中IgG的活性。其中，对照组样品为常压下的牛初乳。

1.2.1 压力大小对牛初乳中IgG的影响 施压温度维持在30℃，保压时间为20min，分别选取0.1、100、200、300、400、500、600MPa的压力条件处理牛初乳，依照IgG的活性检测方法，在450nm下测得样品的吸光度值，计算样品的活性提高率。

1.2.2 施压温度对牛初乳中IgG的影响 在处理压力为350MPa，保压时间为20min，分别选取20、25、30、35、40℃的温度条件处理牛初乳，依照IgG的活性检测方法，在450nm下测得的吸光度值，计算样品的活性提高率。

1.2.3 保压时间对牛初乳中IgG的影响 在处理压力为350MPa，施压温度为30℃，分别选取0、10、20、30、40、50、60min的保压时间处理牛初乳，依照IgG的活性检测方法，在450nm下测得样品的吸光度值，计算样品的活性提高率。

1.2.4 超高压处理对牛初乳中IgG活性影响的条件优化 选用处理压力、施压温度和保压时间作为实验因素，进行正交实验L9（33），选取样品处理后活性提高较大的压力、温度和时间组合。正交实验设计见表1。

表1 L9（33）正交实验因素水平表Table 1Factors and levels table of L9（33）orthogonal experiment

1.3 IgG的活性检测

1.3.1 IgG标准品的检测 在用纯化的抗原包被的ELISA反应板上设标准品孔，按顺序加入标准品及标准品稀释液，稀释后各孔加样量为50μL，浓度分别为24、16、8、4、2μg/mL，每个溶度均设置三个平行。根据酶标仪读出OD450nm值，以IgG的质量浓度为横坐标，以吸光度值为纵坐标，绘制不同质量浓度的IgG标准曲线。

1.3.2 牛初乳中IgG活性的检测 在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μL，然后再加稀释100倍后的待测样品10μL，封板后37℃温育30min，板清洗5次（每次清洗时，每个孔都加满洗涤液，然后静置30s，倒掉洗涤液后用力拍干），加50μL酶标试剂至每个孔，空白孔除外，再次封板，37℃温育30min，板再次清洗5次（同上）。结束后，每个孔先加入显色剂A 50μL，再加入显色剂B 50μL，混匀后37℃避光显色15min，加50μL终止液至每个孔以终止反应，将酶标板置于酶标仪中于450nm下测定吸光度值。每个样品平行测定三次，取平均值。样品最终的稀释度为500倍。

1.4 活性提高率的计算

计算公式如下：

活性提高率（%）=（超高压处理后样品的IgG含量-对照组样品的IgG含量）/对照组样品的IgG含量×100

式中：对照组样品在0.1MPa下处理。

1.5 数据处理

数据分析和图表制作利用软件Excel 2007。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制

按照1.3.1方法进行检测，结果如图1所示。

图1 ELISA试剂盒测定牛初乳中IgG的标准曲线Fig.1 The standard curve of determination of immunoglobulin G in bovine colostrum by ELISA Kit

由图1可见，经ELISA试剂盒测定牛初乳中IgG的吸光度值，所获得的标准曲线方程为：y=0.0769x-0.0351，相关系数为：R2=0.9986，说明在所测的浓度的范围内标准曲线的相关性较好。

2.2 压力大小对牛初乳中IgG的影响

图2 压力对牛初乳中IgG的影响Fig.2 Effect of pressure on immunoglobulin G of bovine coloctrum

由图2可以看出，与常压下的对照组相比，经过超高压处理后，IgG的活性明显提高。当压力从常压逐渐升高到200MPa时，随着压力的增大，IgG的活性也随之增大。其中在200MPa时，牛初乳中IgG的含量值为4.9441mg/mL，与常压下IgG含量值为2.7445mg/mL相比，活性提高率为80.15%，在所测的压力范围内，达到最大值。当压力从200MPa继续上升至600MPa时，随着压力升高，牛初乳中IgG活性的增加量减小，活性提高率虽然呈现出下降的趋势，但变化平缓，即使在600MPa时，牛初乳中IgG的含量值为4.5501mg/mL，与对照组比较，活性提高率为65.79%。

2.3 施压温度对牛初乳中IgG的影响

图3 温度对牛初乳中IgG的影响Fig.3 Effect of temperature on immunoglobulin G of bovine coloctrum

由图3可以看出，经过超高压处理以后，与常压下的对照组相比，牛初乳中IgG的活性均增大，而且IgG的活性变化与超高压处理的温度有很大的关系。在20～25℃的范围内，随着温度的升高，牛初乳中IgG活性的增加量减少，当施压温度为25℃时，样品中IgG的含量值为4.3329mg/mL，常压下样品中IgG的含量值为2.7464mg/mL，活性提高率为57.77%。在所测温度范围内，25℃时活性增加量最小。继续升高温度，在25℃到40℃这段温度范围内，IgG的活性随着温度的升高而增大。尤其是在25～35℃之间，活性变化曲线近似为线性关系，上升趋势明显，而从35～40℃的温度变化范围内，曲线逐渐趋于平缓。其中，在35℃时牛初乳中IgG的含量值为5.0364mg/mL，活性提高率为83.38%，40℃时测得IgG的含量值为5.1222mg/mL，活性提高率为86.51%。

2.4 保压时间对牛初乳中IgG的影响

图4 时间对牛初乳中IgG的影响Fig.4 Effect of time on immunoglobulin G of bovine coloctrum

图4显示，牛初乳中的IgG经过超高压处理以后活性明显提高，而且在所测时间范围内，IgG的活性随着保压时间的延长而逐渐增大。当保压时间在0～30min时，活性变化率曲线直线上升，活性增加较大；常压下测得牛初乳中IgG的含量值为2.7445mg/mL，而保压时间为30min时，测得牛初乳中IgG的含量值为4.9096mg/mL，与对照组相比，活性提高率为78.89%。当保压时间在30～60min范围内时，活性随着保压时间的延长继续增大，但提高率曲线的增幅减小，上升的趋势变得平缓。当保压时间达到了60min时，测得牛初乳中IgG的含量值为5.1651mg/mL，与对照组相比，活性提高率为88.20%，但与保压时间为30min相比，IgG的活性提高率仅改变了9.31%，说明保压时间在30～60min时间范围内，延长保压时间对IgG的活性影响不大。

2.5 超高压处理对牛初乳中IgG活性影响的条件优化

表2 L9（33）条件优化实验结果Table 2 The test results of optimization

由正交表分析k值可得，三个因素中均为第2个水平的数值最高，最优组合为A2B2C2，即为500MPa、35℃、20min；由极差分析结果可知：RA＞RC＞RB，因此上述三种影响因子对牛初乳中IgG活性的作用大小顺序为压强、时间、温度。

根据优化条件进行重复验证实验，IgG活性的OD450nm值为0.8367，活性提高率为105.08%。该检测结果与正交表中第5组组合（500MPa，35℃，25min）结果（106.42%）相比，提高率相近，无显著差异，所存在差异可能为检测误差。因此，优化条件为500MPa、35℃、20min，在该条件下处理牛初乳，其IgG活性将大幅提高。

3 讨论

IgG分子是由通过两个二硫键（-S-S-）相连接的两条轻链（L链）和两条重链（H链）所组成[17]，其结构区域又可分为位于C端的稳定区（C区）和位于N端的可变区（V区），其中可变区域是由轻链和重链末端所组成的，又可分为超变区（HVR）和骨架区，抗原与抗体发生特异性结合反应的位置就是在此超变区域，通过改变超变区域段的结构形状从而实现对不同抗原的识别作用，达到被动或主动免疫的目的[18]。

Masuda T等[19]采用SDS凝胶电泳检测牛初乳中的免疫球蛋白的研究表明：IgG对高压处理具有抵抗性，在室温条件下、保压时间为10min，当施加压强小于400MPa时，免疫球蛋白几乎没有影响。Felipe X等[20]研究表明，免疫球蛋白即使在压力为500MPa、温度为25℃的条件下都不会发生变性，只有更高的压力和温度才会导致其发生变性。张和平等[21]采用荧光分光光度计法在284nm激发波长条件下溶液的最大发射波长和荧光强度来检测IgG，其中IgG的处理压强为200～700MPa、保压时间为20min、施压温度为室温，研究表明，其他物质如蔗糖的存在对IgG发生变性具有保护作用，而且物质的浓度越大，IgG在高压下的稳定性越好。

程金波等[22]采用不同的加热方式处理牛奶，通过双抗体夹心法ELISA方法检测乳中IgG的含量，结果显示，乳品工业中常用的巴氏杀菌对于牛乳中的IgG影响并不大，在63℃的条件下处理30min，IgG的活性几乎不受任何影响，即使在75℃温度下处理15s，乳中IgG的变性率也仅约为9.3%。Indyk HE等[23]采用光学生物传感器免疫测定技术，利用同步检测牛体内抗IgG的抗体和蛋白质G的含量来检测IgG的活性，研究发现，IgG在温度高于60℃时才表现出对热不稳定的状态。岳喜庆等[24]在研究牛初乳免疫球蛋白体外稳定性的实验中观察到，牛初乳免疫球蛋白在低于65℃的范围内具有较高的热稳定性，其中，他是采用琼脂双向免疫扩散法检测牛初乳中免疫球蛋白。赵玉娟[25]采用硫酸铵盐析法分离提取出免疫球蛋白，继而采用试管凝集法测其含量，研究证实，在温度低于60℃时，免疫球蛋白的稳定性较好。

4 结论

在实验条件范围内，牛初乳经过超高压处理后，在优化条件（压强为500MPa、施压温度为35℃、保压时间为20min）下处理牛初乳，其IgG的活性有很大提高。Indyk HE等[23]研究还表明，温和的热处理和加压处理对牛初乳中的IgG活性具有促进作用。这与本实验所得结果一致。无论是升高温度、压强，还是延长保压时间，牛初乳中IgG的含量均呈增加的趋势，这是因为超高压处理改变了IgG的分子结构，可变区域的结构形状也随之发生变化，使之更易与抗原发生特异性结合反应，或与之结合的更加紧密，导致了吸光度的增加，活性的增强。因此，适当的高压处理改善了免疫球蛋白的活性，提高了牛初乳的免疫功能。

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