大孔吸附树脂纯化水芹总黄酮的研究

陈况况，章宏慧，刘东红，叶兴乾，陈健初

（浙江大学生物系统工程与食品科学学院，浙江杭州310058）

水芹（Oenanthe Javanica）为伞形科植物，分布于河南、江西、江苏、安徽、浙江、湖北、广东、湖南、四川、广西、台湾等地，是我国传统特色水生蔬菜的重要种类。水芹含有多种氨基酸、挥发油及黄酮类化合物，其中黄酮类物质含量很高，具有降血压、降血脂、保护心血管和增强机体免疫力的作用[1]。有关文献研究了从水芹中提取黄酮类物质的方法和工艺条件，主要以有机溶剂加热回流提取为主[2-3]。但有机溶剂提取出来的不仅有黄酮类物质还有大量的糖类蛋白色素等杂质，影响了对其黄酮类物质生理活性的进一步研究。大孔树脂是近10年来发展起来的一类有机高分子聚合物吸附剂，其理化性质稳定，不溶于酸碱及有机溶剂，不受无机盐类及强离子、低分子化合物的干扰，吸附效果好，再生简便，使用周期长，被广泛用于天然产物的分离纯化[4]。大孔树脂可以通过静电吸附力，氢键结合作用，络合作用和分子筛的作用选择性吸附水溶液或非水溶剂体系的目标成分[5]。很多文献研究了大孔树脂纯化黄酮化合物的工艺、热力学及动力学方程，对吸附和解吸过程中的物理变化进行了阐释[6-8]。本文选用6种不同的大孔树脂对水芹粗黄酮进行静态吸附并进行筛选，探讨了动态吸附的最优工艺条件，为水芹黄酮的富集纯化提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

水芹（Oenanthe javanica（Bl.）DC） 购于浙江省杭州市上城区近江水产农副产品综合市场农贸市场；乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠等 均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司；标准品芦丁、槲皮素、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-L-鼠李糖苷、山奈酚 美国Sigma公司；乙腈 色谱纯，美国tedia公司；AB-8、ADS-17、NKA-9、NKA、D101、X-5六种大孔树脂 河北沧州宝恩公司，该公司生产的六种大孔树脂的型号和特性见表1。

UV-2550型紫外-可见分光光度计 日本Shimadzu公司；水浴摇床 江苏金坛亿通电子有限公司；BCW203型旋转蒸发仪 上海贝凯生物化工设备有限公司；层析柱 内径×长度=26mm×30cm，容积150mL（1BV=150mL），上海嘉鹏科技有限公司；Agilent SBC18色谱柱（4.6×250mm，5μm），Waters e2695型高效液相色谱仪。

表1 六种大孔树脂的型号和特性Table 1 Property of six types of macroporous resin

1.2 实验方法

1.2.1 水芹黄酮的提取 参照刘恒蔚[9]和毛飞[10]的方法并加以修改，将新鲜水芹于鼓风干燥箱中于60℃下烘干，粉碎过25目筛，称取100g水芹干粉，以70%乙醇水浴加热回流2.5h，加热温度为73℃，抽滤得到水芹黄酮提取液。

1.2.2 总黄酮含量的测定 总黄酮含量的测定参照文献[11]。

1.2.2.1 芦丁标准曲线的绘制 精确称取芦丁21mg，用80%乙醇定容至100mL备用，取7只具塞试管，分别加入0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL芦丁标准溶液，用80%乙醇补足体积至5mL，混匀，各加入0.3mL 5%NaNO2，混匀后静置5min，加0.3mL 10%Al（NO3）3混匀后静置6min，加入4mL 1mol/L NaOH，再加入0.4mL 80%乙醇使体积为10mL，混匀后静置10min，于510nm下测定吸光值。以测定结果制得吸光度与芦丁浓度的标准曲线Y=0.226X+0.007（X：浓度，mg/mL；Y：吸光值），R2=0.999。

1.2.2.2 水芹黄酮溶液中黄酮含量的测定 准确吸取样品液1.00mL置于10mL具塞试管中，按照芦丁标准曲线制作方法测定吸光度，由吸光度根据回归方程计算出质量浓度。

1.2.3 树脂的预处理 将六种大孔吸附树脂AB-8、X-5、NKA、NKA-9、ADS-17、D101分别在95%乙醇中浸泡24h，并不时用玻璃棒搅拌，使树脂和乙醇充分接触，以便从孔中赶出空气。湿法装柱，用蒸馏水洗净乙醇，然后用2BV 5%NaOH溶液冲洗，再用蒸馏水冲洗至中性，之后用2BV 5%的盐酸冲洗树脂，最后用蒸馏水冲至中性。处理完毕后装入烧杯中用蒸馏水浸泡，用时取适量即可[12]。

1.2.4 静态吸附量、吸附率及解吸率的测定 准确称取已处理好的大孔树脂0.5g，置于三角瓶中，加入一定浓度的黄酮提取液10mL，室温下振荡24h至吸附平衡，过滤，测总黄酮浓度[13]。

式中，Q为静态吸附量，mg/g；C0为初始浓度，mg/mL；Cv为剩余浓度，mg/mL；V1为黄酮提取液体积，mL；W为树脂质量，g。

取吸附饱和的大孔树脂用蒸馏水洗至洗脱液无色，过滤，吸干表面水分，加入90%乙醇30mL，室温下振荡12h，将树脂滤出，测定滤液中总黄酮浓度。

式中，Cd为解吸液浓度，mg/mL；V2为解吸液体积，mL；V1为黄酮提取液体积，mL。

1.2.5 树脂富集能力的评价 树脂富集能力的评价参照文献[14]，纯化后样品中黄酮含量的质量分数与纯化前样品中黄酮含量的质量分数之比为树脂对该黄酮粗提物的富集能力。

式中，M1为样品中黄酮质量，mg；M2为样品质量，g。

式中，M3为产品中黄酮质量，mg；M4为产品质量，g。

富集倍数=经大孔树脂富集后产品纯度/上柱纯化前水芹粗黄酮样品纯度。

1.2.6 动态吸附上样速率的选择 将水芹粗黄酮样液以0.5、1.0、1.5、2、2.5mL/min的速率通过AB-8树脂层析柱，收集流出液，并测定流出液中总黄酮的含量，然后用水冲洗至流出液透明澄清，测定水洗液中总黄酮含量。计算不同流速下树脂对黄酮的吸附率。

1.2.7 动态吸附特征曲线 将浓度为（0.37±0.02）mg/mL的黄酮样品液以1mL/min的流速通过装有AB-8大孔树脂的层析柱进行动态吸附，分段收集流出液，每10mL为一份，共收集10份，并测定这10份流出液中黄酮含量，绘制动态吸附曲线。

1.2.8 洗脱剂乙醇浓度的选择 将水芹粗黄酮样液以1mL/min的速率通过AB-8树脂层析柱，收集流出液，并测定流出液中总黄酮的含量，然后用水冲洗至流出液透明澄清，测定水洗液中总黄酮含量。之后分别用8BV 60%、70%、80%、90%、100%乙醇以2mL/min速率洗脱。

1.2.9 洗脱剂体积对解吸效果的影响 确定洗脱剂体积的原则是，在充分洗脱下所吸附的物质前提下，应尽量节省洗脱剂用量。将黄酮含量为（30.70±0.47）mg水芹粗黄酮溶液以1mL/min的上样速度经AB-8树脂进行富集，饱和吸附30min，用蒸馏水洗脱，测定水洗部分黄酮含量。再取8BV 80%乙醇溶液洗脱，控制流速2mL/min，分段收集洗脱液，每1BV为1份，分别测定1、2、……、8BV洗脱液中黄酮含量。

1.2.10 洗脱速率的选择 将水芹粗黄酮溶液以1mL/min流速上样，充分吸附30min后，用水洗脱杂质，再用80%乙醇以1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL/min洗脱，分别收集洗脱液并测定其中黄酮含量。

1.2.11 HPLC法分析纯化前后水芹黄酮的成分及含量HPLC分析条件[15]：色谱柱Agilent SB-C18（4.6×250mm，5μm）；流动相：乙腈-水，梯度洗脱：0～20min，15∶85→35∶65，20～30min，35∶65→45∶55，30～40min，15∶85；柱温：40℃；流速1mL/min；检测波长365nm；进样量10μL。

标准溶液的配制：分别称取0.01g标准品芦丁、槲皮素、槲皮素-3-葡萄糖苷、槲皮素-3-L-鼠李糖苷、山奈酚混合并加色谱纯甲醇溶解，于100mL容量瓶中定容。将标准溶液用色谱级甲醇稀释成不同浓度梯度的系列标准溶液，吸取2mL左右的溶液经微孔滤膜（0.22μm）过滤后置于进样瓶中进行HPLC分析。

用HPLC测得的峰面积为Y轴，标准品质量为X轴，计算得到5种黄酮的标准曲线：芦丁y=132190x+955.67，R2=0.998；槲皮素-3-O-葡萄糖苷y=293080x-17127，R2=0.999，槲皮素-3-L-鼠李糖苷y=174741x-8516.6，R2=0.998；槲皮素，y=112072+1295.2，R2=0.999山奈酚，y=248480x-122273，R2=0.998。

将水芹黄酮提取液浓缩并冷冻干燥后取（10.0±0.20）g溶解在10mL甲醇中进行HPLC分析，取经过最佳工艺纯化后冷冻干燥的水芹黄酮提取物（10.0±0.35）g溶解在10mL甲醇中进行HPLC分析。

2 结果与讨论

2.1 大孔吸附树脂的筛选

大孔吸附树脂在分离物质有效成分时，不仅要求树脂吸附量大，而且还需要有较高的解吸率。因此，吸附率和解吸率测定是筛选树脂的重要环节。由表2可知，弱极性树脂AB-8对水芹黄酮吸附效果较其他树脂要好，吸附率达到了71.37%，而非极性树脂X-5对水芹黄酮吸附效果最差，表明水芹黄酮中非极性化合物相对较少。由表3可以看出，AB-8和NKA这两种树脂对黄酮解吸率较高，分别为76.57%和77.53%，NKA-9解吸效果较差。因为水芹黄酮是弱极性的，容易被弱极性树脂吸附，同时AB-8树脂比表面积较大，洗脱效果较好[16]。因此综合吸附率和解吸率来看，选择AB-8为实验所用大孔树脂对水芹黄酮进行纯化。

大孔树脂吸附过程涉及到热力学和动力学的一些作用，理论上通常认为大孔树脂吸附过程需要经历液膜扩散、颗粒内扩散、吸附反应，一般情况下吸附反应进行比较快，对整个吸附过程影响不大，故液膜扩散和颗粒内扩散成为主要控制吸附过程的因素。周英新[17]研究发现，黄酮类化合物结构对静态吸附存在明显影响，并建立了基于黄酮类分子构型的大孔树脂吸附动力学模型。另外，大孔树脂吸附水溶液中的有机物是依靠范德华力、氢键、疏水作用，静电作用。由此可以推测本实验中水芹黄酮的成分的结构使得它在AB-8大孔树脂中扩散较快，亲和力较强，故能够达到较高吸附量。Zhenbin Chen等[18]研究证明，由于大孔树脂中存在交错的孔结构，吸附过程中发生的毛细管现象将显著影响吸附特性。如果溶液渗透过大孔树脂，发生毛细管液面上升，毛细现象被掩盖。所以毛细现象是否发生取决于溶质对大孔树脂是否能够浸润，如果溶质对大孔树脂是浸润液体，毛细液面下降会发生在溶液穿过大孔隙到小孔隙过渡时期的临界点。但是，如果溶质是不浸润液体，吸附只发生在大孔表面甚至没有吸附，毛细现象不会发生。因此可以推断水芹黄酮溶液对大孔树脂的浸润程度也影响了吸附效果。

2.2 大孔树脂纯化水芹黄酮的工艺条件优化

2.2.1 上样流速的选择 如表4所示，上样流速对吸附率有一定的影响。上样流速越大，流出液中黄酮含量越高，因为黄酮溶液与树脂接触的时间短，不利于黄酮的吸附。理论上流速越慢对黄酮的吸附效果越好，但是为了提高效率缩短时间应选择合理的上样速率，这里选择1mL/min作为上样速率，可使吸附率达到合适的范围同时尽可能节约时间。

2.2.2 动态吸附特征曲线 由图1可看出，流份号为6的溶液黄酮浓度为0.039mg/mL，通常流出液的目标物浓度达到上样液目标物浓度的1/10时，认为达到了目标物的泄漏点，AB-8树脂动态吸附水芹黄酮样品液的泄漏点为60mL。

表2 六种大孔树脂对水芹黄酮的吸附率Table 2 Comparison of adsorption quantity and rate of six types of macroporous resin on flavonoids in Oenanthe javanica

表3 六种大孔树脂对水芹黄酮的解吸率Table 3 Comparison of desorption rate of six types of macroporous resin on flavonoids in Oenanthe javanica

表4 上样流速对吸附率的影响Table 4 Effect of loaded rate on adsorption rate

表5 洗脱剂乙醇浓度对解吸率的影响Table 5 Effect of ethanol concentration on the desorption rate

图1 AB-8树脂动态吸附曲线Fig.1 Dynamic adsorption curve of AB-8 type macroporous resin

2.2.3 洗脱剂乙醇浓度的选择 由表5可以看出，随着乙醇浓度提高，解吸率同时提高，达到80%之后解吸率变化不太明显，因此选择80%乙醇为洗脱剂。

2.2.4 洗脱剂体积对解吸效果的影响 表6所示的洗脱剂用量和解吸率的关系表明洗脱剂用量达到4BV后解吸率达到71.86%±3.41%，之后随洗脱液用量增加，解吸率提高幅度很小，基本保持不变。考虑到综合效益，选择4BV为最佳洗脱体积。

表6 洗脱剂体积对洗脱效果的影响Table 6 Effects of the amount of eluent on elution results

2.2.5 洗脱速率的选择 由表7可知随着洗脱速度增加解吸率呈下降趋势，洗脱流速在1～2mL/min之间变化幅度很小。因此，综合洗脱率和生产效率来考虑可以选择1.5mL/min作为洗脱速率。

2.3 树脂的富集能力

按照以上工艺优化得到的最佳条件，将黄酮含量为（42.60±0.80）mg的水芹粗黄酮溶液以1mL/min的速率上样，用水洗至流出液透明澄清，然后用4BV 80%乙醇溶液以1.5mL/min洗脱，将洗脱液浓缩至无有机溶剂残留，冷冻干燥后称重为（55.57±0.78）mg，将其溶解后测得总黄酮含量为（29.88±0.59）mg产品纯度为53.78%±1.79%。将黄酮含量同样为（42.60±0.80）mg的水芹粗黄酮溶液烘干后称重为（0.602±0.019）g，样品纯度为7.1%±0.10%。树脂富集倍数为（53.78%±1.79%）/（7.1%±0.10%）=7.60±0.36。

2.4 水芹黄酮纯化前后HPLC分析结果

五种黄酮标准品HPLC图谱见图2。如图3所示，纯化前后黄酮种类没有显著变化，均为芦丁、槲皮素、槲皮素-3-L-鼠李糖苷和山奈酚这四种黄酮，并且均未检测出槲皮素-3-O-葡萄糖苷，而10min左右的峰未能有标准品对照，故未能检测出来具体黄酮种类。将得到的峰面积对照标准曲线计算出各个黄酮种类的含量见表8，其中纯化前黄酮含量占提取物总量的6.44%±0.28%，纯化后黄酮含量占冻干样品总量的55.65%±0.89%，总黄酮富集倍数为8.65±0.28，其中芦丁富集倍数较高，为10.05±0.28。

图2 五种黄酮标准品HPLC图谱Fig.2 HPLC chromatogram of five flavonoid standards

表7 洗脱速率对解吸率的影响Table 7 Effects of elution velocity on the desorption rate

表8 纯化前后黄酮含量对比Table 8 Comparision of content of flavonoids before and after purified

图3 经AB-8大孔树脂纯化前后的水芹黄酮HPLC图谱Fig.3 HPLC chromatogram of flavonoids from Oenanthe javanica before and after purified by AB-8 type resin

3 结论

大孔树脂在富集天然产物有效成分的应用较为广泛，影响其纯化效果的因素很多，由于富集纯化实验一般周期较长，误差较大，通常只选择其中较为重要的因素进行考察[19]。通过实验考察了不同条件下AB-8树脂的动态吸附和解吸能力，确定了该树脂的动态吸附和解吸最佳条件为：以1mL/min的速度上样后用水洗至流出液澄清透明，然后用4BV 80%乙醇以1.5mL/min的速度洗脱。经过树脂纯化富集后，纯度由7.1%提高到58.63%，富集倍数为7.6。

另外，对纯化前后的水芹黄酮进行HPLC法检测分析其中成分的变化，发现水芹黄酮主要是黄酮醇类，包括芦丁、槲皮素、槲皮素-3-L-鼠李糖苷、山奈酚。槲皮素是芦丁和槲皮素-3-L-鼠李糖苷的苷元，芦丁比槲皮素多一个二糖，槲皮素-3-L-鼠李糖苷比槲皮素多一个鼠李糖，山奈酚和槲皮素结构相似，故选用芦丁作为对照品，能比较准确反映总黄酮含量。高效液相色谱法测得的以测得的黄酮含量总和为指标计算得到纯化前后总黄酮纯度分别为6.44%和55.65%，树脂对总黄酮的富集倍数为8.65，其中对芦丁的富集倍数达到了10.05。在分析得到的HPLC图谱中尚有未能确定的物质峰，其具体成分和结构有待进一步研究。

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