改性后的骨形态发生蛋白—2聚乳酸纳米微球缓释系统促进下颌骨缺损修复的研究

罗菲　卢来春　曾勇　赵智亮　祝金香　张纲

[摘要] 目的 探讨改性后聚乳酸（PLA）包裹骨形态发生蛋白-2（BMP-2）制备的纳米微球缓释系统对兔下颌骨缺损的修复效果。方法 将PLA进行接枝聚合反应改性后，应用超声乳化法制备PLA纳米微球（PLA-Ns）、BMP-2-PLA

纳米微球（BMP-2-PLA-Ns）凝胶。将45只家兔随机分为3组：空白组、PLA-Ns凝胶组（对照组）、BMP-2-PLA-Ns凝胶组（实验组），建立骨缺损动物模型，对照组植入PLA-Ns凝胶，实验组植入BMP-2-PLA-Ns凝胶，空白组不予特

殊处理。术后第1、2、4周处死家兔，截取缺损区颌骨段，进行影像学、苏木精-伊红（HE）染色、PCNA免疫组织化学染色观察。结果 影像学观察可见：实验组骨缺损区修复良好，阴影不明显，修复效果好于对照组和空白组。HE染色观察可见：实验组和对照组有大量新生血管和继发性骨痂形成，实验组骨痂比例明显高于对照组和空白组。免疫组织化学观察可见：第1、2周，实验组PCNA阳性软骨细胞多于对照组和空白组；第4周，各组PCNA阳性细胞均罕见，PCNA阳性细胞检出率低于第1、2周。结论 BMP-2-PLA-Ns缓释系统能明显促进下颌骨缺损修复。

[关键词] 聚乳酸； 骨形态发生蛋白； 下颌骨； 骨缺损； 修复

[中图分类号] R 782.2 [文献标志码] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.02.010

因肿瘤、外伤等造成的颌骨缺损修复一直是外科医生的一个难题。目前临床上所运用的修复方法都有着不同的局限性，探索更好的骨缺损修复方法是研究的热点。骨形态发生蛋白-2（bone morpho-

genetic protein-2，BMP-2）在体内能够诱导新骨的

形成，在体外对人骨髓基质细胞有强烈的骨诱导活性，能够诱导间充质干细胞增殖分化为成骨细胞，并由诱导性骨细胞向确定性骨细胞转化[1]。研究表

明，BMP-2可以诱导异位骨的形成，并诱导临界骨缺损骨性愈合[2]。由于细胞因子本身的降解速度快，如果单独在缺损区局部应用BMP-2等细胞生长因子，体内作用时间短，不能持续地在体内发挥作用，因而需要采用合适的高分子生物材料为载体包裹BMP-2，以达到缓释效果[3]。聚乳酸（polylactic acid，PLA）由于具有良好的生物相容性和可降解性，被大量用于实验中作为支架材料。但是好的支架材料不但要满足一般的生物材料要求，还需要具备良好的细胞亲和性。PLA的缺点在于缺乏细胞的活性功能基团，不能很好地使材料和细胞相互作用。

本实验针对PLA存在的缺陷，对PLA采用接枝聚合的方法进行表面修饰，改善PLA的亲水性，增加细胞黏附性。以改性后的PLA作为BMP-2纳米微球的缓释载体，制备BMP-2-PLA纳米微球（BMP-2-PLA nanospheres，BMP-2-PLA-Ns）凝胶，以单纯性PLA纳米微球（PLA nanospheres，PLA-Ns）凝胶为对照，研究BMP-2-PLA-Ns缓释系统对颌骨缺损的修复效果，为临床应用打下基础。

1 材料和方法

1.1 主要材料和设备

PLA（济南岱罡生物有限科技公司），重组人BMP-2蛋白（北京义翘神州生物技术有限公司），泊洛沙

姆407（第三军医大学大坪医院药剂科赠送），PCNA

marker（Abcam公司，英国），超声破碎仪（宁波新芝科学仪器研究所）。

1.2 PLA-Ns凝胶、BMP-2-PLA-Ns凝胶的制备

将PLA进行接枝聚合反应改性后，应用超声乳化法制备PLA-Ns、BMP-2-PLA-Ns凝胶。具体制备方法如下。1）PLA改性：PLA置于低温等离子接枝聚合仪反应腔中，等离子处理后通过气相法进行接枝聚合反应改性，将乙烯基吡咯烷酮与PLA接触不同时间进行气相接枝聚合。2）PLA-Ns、BMP-2-PLA-Ns凝胶的制备：将改性后的PLA或者改性后的PLA及BMP-2超声乳化溶于乙酸乙酯溶液中，超声波细胞破碎仪进行超声破碎，形成O/W初乳。吐温80混匀成水相，超声破碎，形成W/O/W复乳溶液。将复乳溶液置于旋转蒸发仪上蒸发，滤膜过滤溶液，得到纳米微球溶液。称取泊洛沙姆在蒸馏水中溶解，配成40%溶液，溶胀，冰浴，在室温下成凝胶状，1∶1比例分别加入制备好的PLA-Ns、BMP-2-PLA-Ns微球溶液，配成凝胶，加蒸馏水搅拌成凝性。

1.3 建立动物模型和标本处理

选取45只健康家兔（第三军医大学新桥医院实验动物中心提供），雌雄不限，体重（2.0±0.2） kg。将

45只家兔完全随机分为3组：空白组、PLA-Ns凝胶组（对照组）、BMP-2-PLA-Ns凝胶组（实验组），每组各15只。建立骨缺损动物模型（图1）：麻醉成功后，常规消毒，铺巾，无菌操作下制备0.5 cm×0.5 cm大小的骨缺损区。根据分组，对照组植入PLA-Ns凝胶，实验组植入BMP-2-PLA-Ns凝胶，空白组不予特殊处理，冲洗缝合。术后第1、2、4周采用空气栓塞法将每组家兔各处死5只，截取缺损区颌骨段，浸泡于10%甲醛溶液中4 ℃固定24 h。

1.4 影像学观察

对缺损区颌骨段进行影像学观察，拍摄侧位片。

1.5 苏木精-伊红（hematine eosin，HE）染色和免疫

组织化学染色观察

对缺损区颌骨段标本进行常规HE染色和免疫组织化学染色，光镜下进行组织学观察。免疫组织化学染色：常规制作标本，石蜡包埋切片，脱蜡，缓冲液洗，滴加一抗PCNA marker和酶标二抗HRP Po-lymer，复染，脱水，透明，封片，光镜下观察。

2 结果

2.1 影像学观察

影像学观察可见：第1周，颌骨缺损区处于水肿期，愈合不明显；第2周，缺损区开始愈合，空白组缺损区阴影明显大于实验组和对照组；第4周，空白组骨缺损区阴影仍然较大，未见明显新生骨形成；对照组骨缺损区阴影缩小，缺损区周围有新骨形成；实验组骨缺损区修复良好，阴影已不明显（图2）。实验组对缺损区的修复效果好于对照组和空白组。

2.2 HE染色观察

HE染色观察可见：第1周，缺损区肉芽组织中有炎症细胞和成纤维细胞，实验组可见新生骨小梁；第2周，骨小梁变粗大、致密，有较多的编织骨形成，对照组和实验组的编织骨多于空白组；第4周，实验组和对照组的编织骨进一步增多，成熟，可见大量新生血管和继发性骨痂形成，实验组骨痂比例明显高于对照组和空白组（图3）。

2.3 免疫组织化学观察

免疫组织化学观察可见：第1周，PCNA阳性细胞分布于整个骨痂组织，包括纤维骨痂中的成纤维细胞和软骨痂中各区的软骨细胞，其中以静息区和增殖区软骨细胞阳性表达最强，实验组多于对照组和空白组；第2周，PCNA阳性软骨细胞主要分布于静息区和增殖区，实验组多于对照组和空白组；第4周，各组PCNA阳性细胞均罕见，PCNA阳性细胞检出率低于第1、2周，主要见于静息区少数软骨细胞和部分增殖区软骨细胞（图4）。

3 讨论

组织工程化骨构建是解决骨缺损修复难题的主要方向，但目前有很多问题尚未解决。采用外源性细胞因子诱导新骨的形成来替代移植是一种有效的方法，也取得了一定的进展。

3.1 细胞生长因子和支架载体技术的选择

关于细胞生长因子加快骨缺损修复速度的研究中，BMP-2是应用最多的一种生长因子，且其效果也最好。Urist等[4]报道BMP/磷酸三钙植入肌肉内其

诱导的新骨量比单用BMP大12倍，表明BMP借助载体缓慢释放，不断作用于靶细胞，诱导形成新骨。虽然有动物研究证实，经肌肉给予BMP诱导新骨形成是可行的，但是这种治疗有潜在的风险，如细胞因子持续高浓度表达有可能引发细胞分裂失控，机体组织有恶变的危险[5]。Wijdicks等[6]将BMP-2经皮注射促进骨缺损修复，同样发现BMP有明显成骨作用。目前研究的热点是将BMP-2与载体复合，组成释放系统来促进骨缺损修复。Young等[7]采用纳米微球技术使载体和BMP-2复合，将BMP-2-PLA-Ns制备成凝胶研究，用于促进骨缺损修复的愈合。

制备纳米微球的包裹载体材料，不但要具有良好的生物降解性及相容性，还要具有很好的载药能力。通过载体材料在体内的降解，实现纳米微球的缓释作用。制备纳米微球的包裹材料目前最常用的有PLA和壳聚糖等。本研究采用接枝聚合的方法改进PLA存在亲水性和细胞黏附性的缺陷[8]，运用超声乳化法制备PLA-Ns凝胶和BMP-2-PLA-Ns凝胶。

3.2 BMP-2-PLA-Ns凝胶的优点

PLA作为BMP-2的包裹载体，植入到缺损区内，通过细胞生长因子的缓释作用，达到细胞生长因子在缺损区持续以零级速度释放，在体内刺激成骨细胞增殖、分化，促进缺损区新骨的形成，同时其降解周期与新骨形成基本同步[9]。本研究表明：BMP-2

的缓释能够很好地诱导间充质细胞分化为成骨细胞，从而有效地促进新骨形成。将改性的PLA作为支架材料，制备成BMP-2-PLA-Ns凝胶，可以加速新骨的形成，促进颌骨缺损区愈合，在成骨方面有一定的优越性。影像学观察可见，实验组促进骨愈合以及新骨形成的效果最佳。免疫组织化学染色研究结果提示，在第1、2周实验组PCNA阳性细胞要优于对照组和空白组，但4周时各组PCNA阳性细胞均罕见，这可能是由于增殖细胞数量满足骨折修复需要后，分化就成为细胞的主要活动。

本研究表明：BMP-2-PLA-Ns缓释凝胶可以加速兔下颌骨缺损区的新骨形成，促进愈合，但今后还需要进一步解决微球释放与骨缺损修复的同步问题，以及PLA降解产物为酸性对组织愈合的影响等。

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（本文编辑 李彩）