金属蛋白酶组织抑制剂对涎腺腺样囊性癌表达β—肌营养不良蛋白聚糖的影响

郝艳梅 马佳 司晨晨 徐佳 景捷

[摘要] 目的 研究涎腺腺样囊性癌（SACC）中β-肌营养不良蛋白聚糖（β-DG）的表达情况，探讨金属蛋白酶组织抑制剂（TIMPs）对SACC细胞表达β-DG的影响。方法 采用免疫细胞化学染色法检测经不同浓度（10、15、20、25 μmol·L-1）TIMPs作用后SACC肺高转移株ACC-M和肺低转移株ACC-2中β-DG的表达情况，以未经TIMPs作用的ACC-M和ACC-2细胞作为对照。收集7例SACC患者的肿瘤组织样本，以10例正常涎腺组织作为对照，采用免疫组织化学染色法检测β-DG的表达情况。结果 未经TIMPs作用前，ACC-2和ACC-M细胞均未见β-DG表达，经不同浓度TIMPs作用后，ACC-2和ACC-M细胞β-DG表达均为阳性。10例正常涎腺组织中，β-DG主要表达于腺泡的基膜上；SACC组织的癌巢周围及癌细胞中β-DG表达阴性。结论 SACC细胞外基质和细胞骨架连接处的β-DG发生了断裂，可能使其更容易发生侵袭和转移，而TIMPs能够逆转β-DG的表达，为治疗SACC提供了新思路。

[关键词] 金属蛋白酶组织抑制剂； 涎腺腺样囊性癌； β-肌营养不良蛋白聚糖

[中图分类号] R 739.87 [文献标志码] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.02.002

β-肌营养不良蛋白聚糖（β-dystroglycan，β-DG）是一种跨膜蛋白，是连接细胞外基质和细胞内骨架的重要结构，对维持细胞膜的完整性和信号转导起着关键性作用[1]。人类宫颈癌、乳腺癌、结肠癌、前

列腺癌患者会出现β-DG异常，舌鳞状细胞癌患者有β-DG断裂的现象[2]。涎腺腺样囊性癌（salivary adenoid cystic carcinoma，SACC）是最常见的唾液腺恶性肿瘤之一，侵袭性较强。目前有关SACC中β-DG的研究尚不多见。本研究通过观察细胞骨架与细胞外基质这一连接体是否发生断裂，从抑制SACC基底膜和细胞外基质降解的角度出发，检测金属蛋白酶组织抑制剂（tissue inhibitor of metalloproteinases，TIMPs）调控SACC肺高转移株ACC-M和SACC肺低转移株ACC-2表达β-DG的情况，探讨SACC侵袭和转移的机制，为治疗SACC提供新的理论基础。

1 材料和方法

1.1 主要实验材料

人SACC肺高转移株ACC-M和人SACC肺低转移株ACC-2购至武汉大学保藏中心。主要试剂：GM6001（属于TIMPs的一种，美国Enzo Life Sciences Interna-tional公司产品），胎牛血清、DMEM培养液（HyClone公司，美国），含0.02%乙二胺四乙酸（ethylenedia-

mine tetraacetic acid，EDTA）的0.25%胰蛋白酶（杭州吉诺生物医药技术有限公司），一抗Beta-Dystro-glycan mouse monoclonal antibody（Novocastra Labo-ratories Ltd.，英国），SP9002（生物素标记山羊抗小

鼠IgG）HistostainTM-PlusKits免疫组织化学染色试剂盒、ZLI-9018DABKit/DAB浓缩型DAB试剂盒（北京

中杉金桥生物技术有限公司）。主要实验仪器：CO2恒温细胞培养箱（上海力申科学仪器有限公司），倒置相差显微镜（Nikon公司，日本），超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司），数码显微摄影系统，冰冻切片机等。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 将ACC-M和ACC-2用含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养液在37 ℃、5%CO2条件下培养，当细胞长满80%时进行细胞传代。

1.2.2 GM6001储存液制备 将1 mg GM6001粉末溶于100 μL二甲基亚砜（dimethyl sulphoxide，DMSO）后配制成25 μmol·L-1的储存母液，过滤除菌后，置于

-20 ℃冰箱内保存，备用。使用时稀释，使GM6001浓度分别为25、20、15、10 μmol·L-1。

1.2.3 细胞爬片制备 使用台盼蓝染色进行活细胞计数，确定活细胞数达到全部细胞的95%以上，用含10%胎牛血清的DMEM培养液稀释细胞（密度为每毫升5×104个），接种于经灭菌处理的盖玻片上，待细胞贴壁后，去除培养液，按照实验分组在适宜的条件下继续培养24 h。

1.2.4 实验分组 对照组加含10%胎牛血清DMEM培养液，在37 ℃、5%CO2条件下培养24 h；实验组分别加入含GM6001浓度为10、15、20、25 μmol·L-1的培养液，于同样条件下培养24 h。

1.2.5 免疫细胞化学染色法检测ACC-M和ACC-2中β-DG的表达 将细胞爬片置于冰面上，用4%多聚甲醛固定5 min，PBS洗片3次，每次5 min；将细胞爬片浸入过氧化氢/甲醇溶液（150 μL 30%过氧化氢溶于50 mL甲醇液）中，室温浸泡30 min，再用PBS液洗片3次，每次5 min；滴加山羊血清封闭液，室温下作用30 min，甩去多余液体，不洗。实验组加一抗（一抗与无菌三蒸水的体积比为1∶200），4 ℃孵育过夜，PBS洗片；对照组不加一抗，以PBS液孵育，4 ℃过夜后，PBS洗片。上述步骤完成后，滴加二抗，于37 ℃孵育60 min，PBS洗片；然后滴加辣根过氧化物酶标记的链霉素亲和素复合物于切片上，作用30 min，PBS洗片；最后DAB显色，自来水洗涤，苏木精复染15 s，脱水，透明，封片，置于光学显微镜下观察，数码显微摄影系统成像。结果判定：细胞核为蓝色，β-DG阳性表达者呈棕黄色。

1.2.6 临床标本中β-DG的表达 选择2010年12月—2012年6月在宁夏医科大学总医院口腔颌面外科住院治疗的7例SACC患者采集标本。患者术前未经任何治疗，所有病例均经病理诊断后确诊，所有患者均行手术治疗。7例患者中，男4例，女3例；年龄42～68岁，平均55岁；病史1～6个月，平均3.5个月；原发部位在左侧者2例，右侧者5例。另外取10例涎腺组织作为对照，其中5例取自舌下腺囊肿的正常舌下腺组织，3例取自腮腺多形性腺瘤瘤旁正常组织（切缘在腮腺下极距病灶约1 cm处），2例取自腮腺腺淋巴瘤瘤旁正常组织。所有标本均于术中切取，大小约1.0 cm×1.0 cm×0.3 cm，立即放入冻存管并投入液氮中保存备用。在制作冰冻切片的过程中，切片机的温度要维持在-20 ℃。切片完成后在冰面上用冷丙酮和甲醇固定4 min，PBS反复冲洗，再将冰冻切片浸入3%过氧化氢溶液中，室温浸泡30 min以灭活内源性酶，PBS液洗片，滴加山羊抗小鼠血清封闭液，室温下作用60 min，甩去多余液体，不洗，后续步骤同1.2.5。

1.2.7 统计学分析 用Image Pro-Plus 6.0病理细胞图像分析系统，将各组免疫细胞化学结果进行图像分析，每张切片至少选取5个高倍（40×10倍）视野，

计算出平均光密度值。采用SPSS 19.0统计软件分析数据，不同浓度的GM6001分别干预ACC-M和ACC-2细胞24 h后β-DG表达变化的比较采用单因素方差分析，ACC-M和ACC-2两种细胞株β-DG表达变化的比较采用独立样本t检验，检验水准为双侧α=0.05。

2 结果

2.1 加入GM6001后对ACC-M和ACC-2细胞株β-DG

表达的影响

加入不同浓度GM6001后，用免疫细胞化学法检测ACC-M和ACC-2细胞株中β-DG的表达，结果见表1：实验组与对照组β-DG表达的差异有统计学意义（ACC-M：F=60.247，P<0.05；ACC-2：F=34.453，P<0.05）；GM6001浓度为20 μmol·L-1时，ACC-M和ACC-2中β-DG表达量的差异无统计学意义（P>0.05），

其余3种浓度下，ACC-M和ACC-2中β-DG表达量的差异均有统计学意义（P<0.05）。

加入GM6001前后ACC-M和ACC-2细胞株中β-DG表达的情况见图1～4：加入GM6001前（对照组），

ACC-M和ACC-2细胞株中均无β-DG表达；加入GM6001后，2种细胞株中β-DG表达均为阳性。

2.2 临床标本中β-DG的表达

2.2.1 正常涎腺组织β-DG的表达 正常涎腺组织中β-DG主要位于腺泡基膜上。图5为正常舌下腺组织，可见舌下腺腺泡的外周有一层基膜包绕，基膜β-DG染色为阳性。

2.2.2 SACC组织β-DG的表达 7例SACC临床标本中，癌巢周围及癌细胞中β-DG表达均为阴性。图6

中SACC组织呈管状型，肿瘤细胞排列呈小管状或条索状结构，管状结构的内层衬有导管细胞，外层为肿瘤肌上皮细胞，均未见β-DG阳性染色。

3 讨论

β-DG是广泛表达于各种组织的跨膜糖蛋白，其功能很复杂，与细胞和基底膜的连接有关，而细胞与基底膜的连接对肿瘤细胞的侵袭和转移至关重

要[3]。在胃癌的研究[4]中，β-DG是一种功能性蛋白，在原发性肿瘤和转移性淋巴结中表达降低。在SACC中的表达情况，目前尚不明确。

SACC约占涎腺肿瘤的10%，易沿神经扩散发生远处转移，其远处转移的机制尚不清楚，对其预防和治疗尚无有效的方法。DeAngelis等[5]对24例SACC患者进行了长达22年的临床回访，发现患者5、10、20年的生存率分别为92%、72%、54%。对于SACC治疗方式的选择和预后的评估可能需要结合一些实验室检测指标。

β-DG是基质金属蛋白酶（matrix metalloprotei-

nase，MMPs）的靶点。β-DG被MMPs降解后，造成

β-DG复合体断裂， 使上皮细胞与细胞外基质的连接出现断裂[6-7]。本实验运用免疫组织化学法检测临床组织标本，结果发现：正常涎腺组织表达β-DG，提示β-DG对维持正常涎腺的结构和功能有重要作用；7例SACC组织中β-DG表达缺失，提示细胞与细胞、细胞与细胞外基质之间的连接发生了断裂，意味着癌细胞失去了自限性，获得向邻近正常组织侵袭和转移的能力。应用ACC-M和ACC-2两种细胞株进行体外研究，β-DG的表达情况与组织学的研究结果一致。

TIMPs是MMPs的天然抑制剂，正常情况下在组织细胞中MMPs和TIMPs处于一种相对平衡的状态[8]，如果这种平衡被打破，细胞就会出现病理学表现。有研究[9]表明，TIMP-1会干扰由某些因子的受体复合

物介导的凋亡作用，并能阻止病变发展和促进组织修复。由此可以推测，通过TIMPs调控MMPs有可能逆转β-DG的异常表达，从而影响SACC的侵袭和转移，这为治疗SACC提供了新思路。本研究中，ACC-M和ACC-2两种细胞株的β-DG表达均为阴性，经GM6001干预后，ACC-M和ACC-2的细胞膜均出现了棕黄色的β-DG表达区域，这说明GM6001能够抑制SACC中β-DG的断裂，而且对β-DG的调控是通过抑制MMPs对基底膜的降解实现的。本研究还比较了不同浓度的GM6001干预ACC-2和ACC-M细胞株24 h后β-DG表达的变化，结果提示，低转移细胞株ACC-2在10、15、25 μmol·L-1的GM6001调控下，β-DG表达较高转移细胞株ACC-M为高，说明GM6001对ACC-2中异常β-DG的调控作用比ACC-M明显，其机理还需后续的研究来证实。

本实验分别从细胞和组织水平展开研究，检测到SACC中β-DG表达缺失，通过GM6001的调控，ACC-M和ACC-2两种细胞株均可恢复β-DG的表达。本研究证实了GM6001能够逆转SACC中β-DG的表达，为治疗SACC提供了参考，但其机理还需要进一步研究。

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（本文采编 周学东）