实验性单侧前牙反⌒薷刺宥源笫篦镣蝗砉侵屑鬃磁韵偌に叵喙氐鞍缀蚉TH/PTHrP受体—1表达的影响

郭敏　张婧　鹿蕾　王艳丽　张勉　王美青

[摘要] 目的 探讨实验性单侧前牙反修复体对大鼠髁突软骨中甲状旁腺激素相关蛋白（PTHrP）及PTH/PTHrP受体-1（PTH1R）表达的影响。方法 在6周龄SD大鼠左侧上、下切牙粘接金属不良修复体，使其呈反关系，2、

4、8周后取颞下颌关节（TMJ），苏木精-伊红（HE）染色观察组织形态学变化，免疫组织化学染色及实时定量聚合酶链反应检测PTHrP、PTH1R的表达情况。结果 8周时，实验组髁突软骨出现明显退行性变，PTHrP阳性细胞较对照组显著增多（P<0.01），PTH1R阳性细胞明显减少（P<0.01）；实验组髁突软骨PTHrP mRNA的表达显著高于对照组（P<0.01），而PTH1R mRNA表达明显降低（P<0.01）。结论 髁突软骨PTHrP的高表达因PTH1R的低表达不能有效发挥作用，可能是髁突软骨骨关节病样变的重要分子机制之一。

[关键词] 咬合； 颞下颌关节； 骨关节病； 软骨； 甲状旁腺激素相关蛋白； PTH/PTHrP受体-1

[中图分类号] Q 26 [文献标志码] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.02.003

颞下颌关节（temporomandibular joint，TMJ）髁

突软骨具有终身改建的能力，改建涉及软骨细胞的增殖、分化及凋亡等过程，有许多信号分子参与其调控[1]。甲状旁腺激素相关蛋白（parathyroid hormone-related peptide，PTHrP）是调节软骨内成骨过程的一个重要生长因子，在机体正常组织中广泛表达，具有促进软骨细胞增殖、抑制其分化及凋亡的功能[2-4]。

PTH/PTHrP受体-1（parathyroid hormone receptor-1，

PTH1R）是目前发现的PTHrP的唯一受体，属于G蛋

白偶联受体家族，两者结合后能产生一系列生物学效应[5]。颞下颌关节骨关节病（temporomandibular joint osteoarthritis，TMJOA）是颞下颌关节紊乱病最常见类型之一，以关节软骨退变、软骨下骨重建及滑膜炎症为主要病理特征[6-7]。目前，TMJOA发生的分子机制尚不明确，研究表明：膝关节骨关节病（osteoarth-

ritis，OA）关节软骨中PTHrP/PTH1R表达异常与其病理进展密切相关[8-11]。本实验首次建立单侧前牙反不良修复体咬合紊乱的大鼠模型，观察TMJ髁突软骨受此异常咬合力刺激后的组织学改变及PTHrP/PTH1R的表达变化情况。

1 材料和方法

1.1 实验动物的选择和分组

选取由第四军医大学动物实验中心提供的6周龄雌性SD大鼠60只为研究对象，体重140～160 g。将实验动物随机、等量分为实验组和对照组，适应性饲养3 d后，实验组进行单侧前牙粘接反不良修复体的操作，对照组不做任何处理，同样条件下饲养至实验结束。

1.2 单侧前牙反不良修复体咬合紊乱大鼠模型的

建立

实验组大鼠左侧上下前牙粘接统一规格的金属不良修复体，造成左侧前牙反的异常咬合（图1）。上前牙不良修复体的制作方法为：将25号通乳针切割成2.5 mm长的金属套筒；下前牙不良修复体的制作方法为：将20号注射器针头一端3.5 mm处用钳子钳扁，弯制成与长轴成45°的导板，在长轴上4.5 mm处切割，作为下前牙金属套筒冠。在麻醉、隔湿条件下粘接不良修复体，每天检查，确保其不脱落（整个观察期内无脱落现象），直至实验结束。

1.3 标本的制备

预实验发现实验组大鼠双侧TMJ石蜡切片苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色未见明显组织形态学差异，故分别于模型建立后2、4、8 周，脱颈法处死实验组、对照组大鼠各10只，整体取出左侧TMJ，4%多聚甲醛固定1 d，10%乙二胺四乙酸（ethy-lenediamine tetraacetic acid，EDTA）脱钙液脱钙3周，常规脱水、石蜡包埋、切片（厚约5 μm），行HE染色

和免疫组织化学染色。取各组动物右侧TMJ髁突软骨冻存于-80 ℃冰箱中备用。

1.4 免疫组织化学染色

切片常规脱蜡至水，3%过氧化氢作用10 min，复合消化液作用10 min，抗原修复液修复10 min，正常血清37 ℃封闭30 min，PTHrP多克隆抗体（1∶100）或PTH1R多克隆抗体（1∶50）（sc-9680、sc-20749，Santa Cruz公司，美国）4 ℃孵育过夜，次日37 ℃复温30 min后，经生物素化二抗工作液37 ℃孵育30 min，辣根酶标记链霉卵白素工作液（北京中杉金桥生物技术

有限公司）37 ℃孵育30 min，DAB显色，苏木素复染，脱水，透明，封片。

1.5 实时定量聚合酶链反应（polymerase chain reac-

tion，PCR）检测

根据Genbank中大鼠PTHrP及PTH1R核酸序列设计合成PCR引物。将髁突软骨标本置于液氮中速冻，取出后迅速捣碎，Trizol法提取RNA，定量，按照试剂盒步骤反转录为cDNA。应用Takara公司的SYBR[R] Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒及ABI 7500实时定量PCR系统进行PCR扩增和检测，PCR反应条件为：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，循环40次。

1.6 数据采集和统计分析

在Leica DM 2500显微镜下，应用Leica Qwin软件采集图像，于100倍镜视野下对TMJ髁突软骨前、中、后部分别采图。在Photoshop 8.0环境下选取髁突软骨中1/3处前后向均衡分布的3个450 px×450 px测量框，测量框包括增殖层、肥大浅层和肥大层，计数所选测量框中阳性细胞数目百分比，取平均值作统计分析。采用SPSS 17.0统计软件对实验数据进行分析，采用单因素方差分析比较各时间点实验组和对照组PTHrP、PTH1R阳性细胞数目百分比及PTHrP mRNA、PTH1R mRNA的表达情况。

2 结果

2.1 形态学观察结果

对照组髁突软骨各层细胞排列整齐，界限清晰。8周时，实验组髁突软骨出现显著退变，表现为细胞数目减少，排列稀疏；10个关节中有3个出现明显无细胞区样改变，病变区软骨细胞发生凝固性坏死，胞核固缩，核染色质浓缩，局部出现嗜均质染色（图2）。

2.2 免疫组织化学染色结果

PTHrP主要分布于髁突软骨肥大浅层与肥大层。对照组8周与4周相比，PTHrP阳性细胞数目相当，但8周时髁突软骨明显变薄，细胞总数减少，阳性细胞率较4周组增加。与对照组相比，2周时实验组髁突软骨中PTHrP阳性细胞率明显降低（P<0.05）；4、8

周时髁突软骨中PTHrP阳性细胞率增加（P<0.05，P<0.01）（图3、4）。

PTH1R主要表达于髁突软骨肥大浅层。对照组8周时阳性细胞率较4周时升高。与对照组相比，2、4周时实验组PTH1R表达没有明显变化（均为P>0.05），8周时阳性细胞显著减少（P<0.01）（图5、6）。

2.3 实时定量PCR检测结果

2周时实验组PTHrP mRNA表达较对照组明显下降（P<0.01），4、8周时实验组PTHrP mRNA表达显著升高（P<0.05，P<0.01）。2周时实验组和对照组PTH1R mRNA表达差异无统计学意义（P>0.05），4、8周时实

验组PTH1R mRNA表达明显下降（均为P<0.01）（图

7、8）。

3 讨论

3.1 髁突软骨OA样变大鼠模型的建立

建立动物模型是研究TMJOA的重要途径。到目前为止，有多种方法建立TMJOA模型，如外科手术[12]、间歇性强制开口的异常机械力[13]及基因缺陷小鼠的

自发性OA模型[11]等。自发性OA模型动物来源受限且

疾病进展缓慢；外科方法则需关节腔的开放性手术。因此，上述方法均不能较好地模拟临床TMJOA的发生过程[14]。由于TMJ的特殊受力方式及咬合因素在

TMJOA发生中的重要作用，笔者尝试通过改变大鼠的正常咬合关系建立TMJOA模型，并成功建立了渐进性咬合紊乱导致恒河猴、新西兰大白兔以及SD大鼠髁突软骨退行性变的动物模型[15-17]。由于渐进性

咬合紊乱大鼠模型建立的过程中，分牙皮筋及间隙充填的自凝材料脱落较为频繁，因此设计了单侧前牙反的大鼠模型，结果表明，大鼠单侧前牙反8周后，双侧髁突软骨出现了明显的OA样变，软骨中PTHrP表达增加，其受体PTH1R表达则降低。

3.2 OA关节软骨中PTHrP和PTH1R的表达

Chen等[11]研究发现：在出现明显TMJOA表现之

前，髁突软骨中PTHrP的表达明显低于正常对照组。本研究中2周时髁突软骨内PTHrP的表达明显低于对照组，OA早期PTHrP表达的降低可能是晚期增殖软骨细胞减少、成熟软骨细胞增加的原因。本研究中4、8周时PTHrP的表达明显高于对照组，PTHrP的高表达可能是机体的一种代偿性反应，这与其他研究结果一致。研究发现：兔膝关节OA关节软骨中PTHrP的表达升高且主要定位于增殖区域的软骨细胞[18]。使用膝关节制动法诱导兔膝关节OA，实验8周后关节软骨中PTHrP的表达显著高于正常组[9]。

Becher等[10] 研究发现：OA样变关节软骨中PTH1R阳性细胞显著减少，且与OA形态及组织学评分呈负相关。Sanchez等[19]将OA的软骨细胞与来源于正常和硬化区的软骨下骨成骨细胞共培养后发现，硬化区来源的成骨细胞可以诱导软骨细胞PTH1R基因的表达显著降低。本研究中2、4周时PTH1R表达的变化不明显，而8周时髁突软骨中PTH1R mRNA和蛋白表达均显著低于对照组，因此PTH1R表达的降低可能是TMJOA病变程度加剧的一个重要表现。

PTHrP可以促进软骨细胞增殖，抑制软骨细胞肥大分化，OA时异常活化可以延缓软骨细胞丢失，是机体对退变病损的一种保护性反应，具有促进关节软骨修复的作用[9]。软骨细胞通过凋亡或坏死而死

亡，是OA软骨退变的重要病理特征，也是OA进展的主要原因。Henderson等[4]研究发现：PTHrP有抑制软骨细胞凋亡的作用。然而OA关节软骨中PTH1R的表达明显减少，PTHrP的作用不能充分发挥。

综上所述，单侧前牙反不良修复体可导致TMJ髁突软骨出现退行性变，PTHrP的表达升高和PTH1R的表达降低。高表达的PTHrP未能与足够的PTH1R相结合，不能有效地发挥作用，这可能是髁突软骨OA样变的重要分子机制之一。因为预实验中未见双侧关节明显组织形态学差异，本实验将左右侧关节分开，一侧用于免疫组化染色，另一侧用于实时定量PCR检测，发现两侧结果较吻合。然而，单侧前牙反的异常咀嚼造成两侧TMJ的运动方式不一致，两侧关节OA样变或许还有不同，仍需进一步研究。

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（本文采编 陈谦明）