液质联用法测定辣椒红色素中罗丹明B含量

2013-05-07周鹏余清林钦戴明郑小严

食品研究与开发 2013年4期

周鹏，余清，林钦，戴明，郑小严

（1.福建省产品质量检验研究院，福建福州350002；2.南京理工大学化工学院，江苏南京210094）

辣椒红色素是以辣椒为原料，经过提取、分离、精制而成的天然色素，其主要功能成分为辣椒红素和辣椒玉红素，而其中脂肪酸含量占80%～85%。它具有色泽鲜艳，着色力强，耐光、热、酸、碱，且不受金属离子影响；该产品广泛应用于水产品、肉类、糕点、色拉、罐头、饮料等各类食品和医药的着色[1]。

由于辣椒红色素从天然辣椒中提取，成本相对较高，少部分不法商贩为了降低生产成本提升产品的着色效果，在产品中非法添加禁用物质罗丹明B。由于罗丹明类染料具有潜在的致癌和致突变性，中国卫生部已经将罗丹明B列在《食品中可能违法添加的非食用物质和易滥用的食品添加剂品种名单（第一批）》[2]中，禁止在食品及食品相关产品中使用。目前对于罗丹明B的分析方法主要有液相色谱法[3]、液相色谱－串联质谱法[4－5]，因液相色谱串－联质谱法具有优越的定性定量能力，极高的灵敏度以及抗干扰能力，逐渐成为非法添加物分析鉴定的主要手段。由于辣椒红色素是天然提取物，组分复杂，并且含有大量的油脂，现有的分析方法不能满足该类样品的分析测试需要，给不法分子留有可乘之机。因此，急需发展一种能够快速、准确、高灵敏的方法检测辣椒红色素中罗丹明B的含量。

1 材料与方法

1.1 仪器、试剂与材料

1.1.1 试剂与材料

罗丹明B标准品：纯度大于95%（德国Dr.公司）；甲醇、乙腈、正己烷、环己烷、乙酸乙酯均为色谱纯（美国Merck公司）；甲酸：优级纯（美国Merck公司）。中性氧化铝：柱层析用，100目～200目（国药集团）；碱性染料专用小柱：60 mg/3cc（福州蓝昊生物医药有限公司）；滤膜：0.22 μm尼龙滤膜（津腾公司），实验样品为市售样品。

1.1.2 仪器

液质联用仪：液相部分 Agilent 1290，质谱部分Agilent 6460三重四级杆质谱仪，均为美国安捷伦科技公司；Avanti J－E冷冻高速离心机：美国贝克曼公司；DS－8510 DTH：超声波清洗机。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液及试剂的配制

标准品的配制：准确称取0.0526g罗丹明B标准品于100mL容量瓶中，用甲醇溶解定容作为标准储备液。准确移取适量标准储备液，用空白提取液稀释成0.50 μg/mL～102.20μg/mL的标准系列；酸化甲醇：取200 mL超纯水加入20mL甲酸，用甲醇定容至1000mL，配制成80%酸化甲醇（含2%甲酸）；甲醇饱和正己烷：取100mL甲醇加入400mL正己烷，剧烈振摇混合后静置分层，上层即为甲醇饱和正己烷；0.3%甲酸水溶液：准确移取3.0 mL甲酸溶液，用超纯水稀释定容至1000mL。

1.2.2 样品前处理方法

称取约5.0 g试样于50 mL离心管中，准确加入20.0 mL酸化甲醇，振摇混匀后置于超声波清洗机中超声提取30 min，超声过程中每隔10分钟振摇一次。超声结束后置于离心机中4℃下15 000 r/min离心5 min，取上层清液约2 mL于10 mL刻度试管中，加入约2 mL乙腈饱和正己烷涡旋2 min，静置分层，取下层液体于2 mL离心管中，置于离心机中，4℃下20 000 r/min离心5 min，取下层清液过尼龙滤膜，弃去前面约1 mL溶液，后1 mL溶液过滤至进样小瓶中上机测试。

1.3 色谱质谱条件

1.3.1 色谱条件

色谱柱：Waters BEH C182.1×50 mm 1.7 μm；柱温：40℃；进样量：2.0 μL；流动相 A：0.3%甲酸水，流动相B：乙腈；流速：0.3 mL/min；梯度洗脱程序为：0～3min，10%B→80%B；3 min～4 min，80%B；4.01 min ～ 5 min，10%B。

1.3.2 质谱条件

离子源：电喷雾离子源（ESI）；扫描方式：正离子模式；监测模式：多反应监测（MRM）；脱溶剂气温度：350 ℃；脱溶剂气流速：5 L/min；雾化气压力：55 psi；鞘气温度：400 ℃；鞘气流速：12 L/min；毛细管电压：4500 V；喷嘴电压：0 V；采用多反应监测模式（MRM），监测离子对为：443/399、443/355，定量离子对为 443/399。

2 结果与讨论

2.1 液相色谱及质谱条件的选择

在实验过程中我们分别比较了不同流动相对峰形的影响，其中流动相的pH对罗丹明B的峰形及响应影响比较大。当流动相中不添加甲酸时，峰变形严重，不能正常辨识哪个峰是罗丹明B，当流动相中添加适量甲酸后，峰形变得尖锐且响应迅速增大，当水相中的甲酸浓度在0.2%至0.5%之间时，峰形良好，且响应也较为稳定，因此我们采用0.3%甲酸水溶液作为水相。这说明了流动相中添加适量甲酸不仅有利于罗丹明B的离子化，而且有利于改善其在C18柱上的保留。

取浓度为5.0 mg/L的罗丹明B标准溶液，不经过色谱柱的分离，直接进入质谱进行条件优化。主要对离子源参数中的脱溶剂气温度、脱溶剂气流速、雾化气压力、鞘气温度、鞘气流速、毛细管电压、喷嘴电压等参数以及多反应监测条件中的毛细管电压、碰撞能量等参数进行了优化。

2.2 样品的提取与净化

2.2.1 提取与净化方法的选择

试验中比较了酸化甲醇提取正己烷净化、乙酸乙酯环己烷溶解GPC净化、以及正己烷溶解中性氧化铝小柱净化、酸化乙腈提取碱性染料专用小柱净化法等处理方法。GPC净化法由于罗丹明B无法与油脂正常分离，回收率很低，并且罗丹明B的极性较强，在乙酸乙酯正己烷溶液中溶解度低，当试样浓度高时，回收率也较低。采用由于中性氧化铝的活度不易控制，导致采用中性氧化铝小柱净化回收率不稳定。采用酸化乙腈提取碱性染料专用小柱净化法由于提取液中含油量较高，加水稀释后乳化现象严重，导致过碱性染料专用小柱净化时小柱堵塞严重，回收率较低。

综合以上实验结果分析，采用酸化甲醇提取正己烷净化方法简单、处理时间短、实验结果稳定可靠，适合质检类实验室进行大批量样品的处理，因此本实验采用该方法为样品处理方法。

2.2.2 提取与净化方法的优化

由于罗丹明B在甲醇、乙腈中的溶解度较好，因此我们首先研究了不同浓度的甲醇或乙腈对提取效率的影响，如图1所示。

分析结果表明：80%甲醇的提取效率最高，并且当有机溶剂比例低于80%时，提取液乳化现象明显，且有机溶剂比例越低，乳化越严重，即使经乙腈饱和正己烷净化，20 000 r/min离心后也很难破乳，也可能影响到回收率。因此，我们选用80%甲醇为提取溶剂。

罗丹明B是属于碱性染料，提取液的pH对其提取效果有较大的影响，我们在80%甲醇中分别加入不同比例的甲酸溶液，对加标样品进行分析测试，如图2所示。

实验结果表明：pH对提取效率的影响较大，当甲酸浓度超过2%以后，峰面积变化不大，因此我们采用80%甲醇溶液中加入2%甲酸作为提取溶剂。

根据以往的实验经验，很多色素、染料尤其是碱性染料与滤膜的作用比较明显，在过滤过程中会被滤膜所吸附，造成含量下降。因此，我们采用过滤标准溶液的方式，尝试了3种常用于过滤有机溶液的滤膜，分别为：尼龙滤膜、PVDF滤膜及PTFE滤膜，考察它们对罗丹明B的吸附作用。实验结果表明：过不同滤膜过滤后，峰面积变化明显，其中过尼龙滤膜回收率为84.6%，过PTFE滤膜回收率为79.5%，过PVDF滤膜回收率为11.5%。这说明了3种滤膜对罗丹明B均具有较为明显的吸附作用，尤其是PVDF滤膜，吸附量接近90%，这将严重影响到分析结果的准确性。

为了降低滤膜对罗丹明B吸附所造成的影响，在过滤时先弃去约1 mL的滤液后再收集剩下的滤液，降低滤膜对罗丹明B吸附的影响。实验结果表明：先弃去1 mL滤液后，收集到的样品含量均有明显提升，其中尼龙膜回收率达98.9%，PTFE滤膜回收率接近100%，PVDF滤膜达82.8%，分别比先前直接过滤收集滤液的方法提高回收率达14.3%、20.5%、71.3%，考虑到液质联用仪定量允许的误差，尼龙滤膜及PTFE滤膜均能满足实验要求，虽然PVDF滤膜回收率提高幅度最大，但是由于其吸附容量较大，经过该方法处理后回收率还是偏低，不适合在本实验中使用。同时，为了降低试验成本，本实验后续的滤膜均采用了尼龙滤膜。