人皮肤成纤维细胞的分离培养及鉴定＊

吴艳红 邓安彦 李晓红 曾文光 左凤琼

（1.四川省人民医院输血科，四川 成都 610072；2.南充市中心医院输血科，四川 南充 637000；3.四川大学华西药学院生化教研室，四川 成都 610041；4.遂宁市中医院检验科，四川 遂宁 629000；5.四川大学华西基础医学与法医学院，四川 成都 610041）

成纤维细胞（Fibroblasts，Fbs）是皮肤真皮网织层中最重要的细胞，主要存在于疏松结缔组织中，能合成和分泌大量胶原蛋白，对维持皮肤的弹性和韧性具有重要作用［1］。在皮肤的烧伤、撕脱伤等创伤均会造成不同程度的细胞变性、坏死，需要通过细胞增生和细胞间基质的形成来进行组织修复。在衰老或损伤的皮肤修复过程中加入自体和／或异体的成纤维细胞，可以使构建的真皮具有更有细胞活性，更能迅速促进表皮细胞的迁移和增殖，从而快速修复衰老、损伤部位，使皮肤变年轻或创伤迅速愈合。真皮的构建所需要的种子细胞－成纤维细胞在体外分离培养后，随着传代次数的增加增殖能力逐渐下降，因此建立一种稳定的、高效的成纤维细胞的分离培养方法具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 标本 临床无菌切除幼儿包皮。

1.1.2 试剂及抗体

高糖－DMEM培养基购自成都哈里公司；小牛血清购自Gibco公司；25cm2塑料培养瓶购自Thermfisher公司；胰蛋白酶及Ⅱ型胶原酶均购自Sigma公司。兔抗波形蛋白（Vmientin）抗体购自博士德公司；余试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 原代培养

取临床无菌切除幼儿包皮，于超净工作台上用含青霉素100U·ml－1、链霉素100U·ml－1的PBS充分洗涤，D－hanks清洗一次，剔除皮下组织后用无菌眼科剪将皮肤标本剪成小块，放置于Ⅱ型胶原酶消化液中4℃消化过夜，24h后于超净台中无菌分离表皮和真皮。弃表皮，将真皮剪碎，然后转移至0.25%胰蛋白酶（不含EDTA）中约15min，以含10%小牛血清的高糖－DMEM培养液终止消化，2000r·min－1离心5min，将沉淀物接种于25cm2塑料培养瓶，加约4ml含10%小牛血清的高糖－DMEM培养液，注意勿使组织浮起，将培养瓶置于37℃、5%CO2培养箱中，次日补加培养液5ml。原代细胞长满约80%以上即可传代，传代时用0.25%胰酶（不含EDTA）消化，倒置显微镜下见胞体回缩时轻拍培养瓶，并接着加入含10%小牛血清的DMEM－高糖培养液中止消化，吸管轻轻吹打瓶壁细胞，并将细胞收集于10ml离心管。2000r·min－1离心5min，弃上清，按1：3接种传代，常规培养。

1.2.2 成纤维细胞的组化鉴定

取P4代细胞以3－5×104个·ml－1接种于预先放有无菌盖玻片的6孔板内制作细胞爬片，37℃、5%CO2培养4h后取出爬片，PBS洗3次。4%的多聚甲醛（pH 7.2）固定细胞30min，PBS洗3次。接下来按试剂盒操作说明进行细胞鉴定采用免疫化学染色S－ABC法，一抗为波形蛋白（Vimentin）兔抗单克隆抗体，按1∶100比例稀释，新鲜配置的DAB显色液，室温下显色约为2－3min，复染，封片。光学显微镜100倍视野下观察计数阳性细胞，计算阳性细胞数的百分比。

2 结果

2.1 细胞形态

接种后24h观察可见有很多长梭形的细胞从组织块周边迁出，也有部分多边形的上皮细胞迁出成团生长，另外可见少量折光强的圆形细胞，见图1，该细胞随换液和传代逐渐去除。一般5－6d后原代细胞铺满瓶底80%－90%时进行细胞传代，传代比例1∶3。传代后细胞形态较清楚，基本只见胞体细长呈长梭形，核卵圆形居中的成纤维细胞，见图1，细胞长至汇合度达90%左右时时细胞呈栅栏状、漩涡状、菜花状生长，5－6d后长至汇合度90%以上，可连续传代20次以上。

2.2 免疫组化

细胞爬片经过固定后，按试剂盒说明书进行操作。通过摸索一抗和二抗浓度，发现在一抗抗Vmientin浓度为1：100，二抗抗山羊抗兔IgG－辣根过氧化物酶浓度为1：200时细胞爬片的免疫组化效果最好，我们的结果显示试验组成纤维细胞几乎100%Vimentin表达阳性，而阴性对照爬片无阳性产物，见图2。

图1 原代培养细胞（4×10） 传代培养细胞（10×10）

图2 免疫组化阴性对照 免疫线化阳性结果

3 讨论

不同的细胞，由于具有不同的功能，分布着不同的蛋白质。上皮细胞具有特异的角蛋白，肌细胞具有特异的桥连蛋白，而成纤维细胞则包含有特异的波形蛋白。利用其特异标志蛋白，可以成功鉴定成纤维细胞［2］。本研究利用胰蛋白酶和胶原酶联合消化法培养皮肤成纤维细胞，免疫组化显示我们所分离培养的细胞波形蛋白阳性，结合分离时的组织来源，以及其生长形态特点，证实其为成纤维细胞，表明我们培养成纤维细胞的方法是稳定可行的。

成纤维细胞是皮肤真皮层疏松结缔组织中，能合成和分泌胶原蛋白、弹性蛋白、纤维连接蛋白、层黏蛋白等细胞外基质（Extracellular matrix，ECM）［3］。胶原蛋白是细胞外基质中的主要结构蛋白。当皮肤衰老时，细胞外基质中胶原蛋白含量逐渐降低，导致真皮层结构发生改变，皮肤失去弹性，出现皱纹［4，5］。成纤维细胞的成功培养可为人类凹陷性瘢痕修复和美容除皱提供可靠的细胞来源，并且为解决皮肤的大面积创面修复提供了光明的前景。

1 吴国平，周燕，谭文松，等.人皮肤成纤维细胞在二维和三维培养系统中的生长代谢特性［J］.中国组织工程研究与临床康复，2007，11（1）：74－77.

2 杨志明主编.组织工程学［M］.北京：化学工业出版社，2002，155－158.

3 吴国选，伍津津，朱堂友，等.人皮肤成纤维细胞库的构建［J］.实用医学杂志，2005，22（4）：324－326.

4 王曦.成纤维细胞与皮肤老化［J］.中国美容医学，2005，14（2）：243－245.

5 Ori T，Okumura M，Matsuura M，et al.Effects of chitinand it s derivatives on the proliferation and cytokine production of fibroblasts in vitro［J］.Biomaterials，1997，8（13）：947－951.