褪黑素受体MT1 和转录因子Sp1 在乳腺癌组织中的表达及临床意义

曾建，陈丽萍，陈淼，陈艳，许豪勤，狄荣科

(1.江苏大学基础医学与医学技术学院，江苏 镇江212013;2.镇江市人口与计划生育委员会，江苏 镇江212001)

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一，严重危害患者生命健康。褪黑素是一种主要由松果体合成并分泌的吲哚类激素，具有抗氧化、抗肿瘤、调节生物节律、参与免疫调节等多种功能［1]。近年来，人们越来越关注褪黑素对乳腺癌的抑制作用。Sanchez-Barcelo 等［2]研究发现，褪黑素可以通过褪黑素受体1(melatonin receptor，MT1)途径降低细胞内cAMP水平，阻断雌激素信号转导通路，抑制雌激素受体(ER)α 阳性乳腺癌细胞的增殖和侵袭。Collins等［3]研究显示，MCF-7 乳腺癌细胞中MT1 的表达有助于褪黑素的抗肿瘤细胞增殖作用，MT1 表达水平越高，褪黑素的抗肿瘤增殖作用越强。

转录因子Sp1(transcription factor Sp1)是一种DNA 结合蛋白，通过调控富含GC/TC 序列的启动子的表达，参与细胞增殖、分化、凋亡等多种功能的调节［4]。Maor 等［5]指出，ER 通过与转录因子Sp1相互作用，调节乳腺癌细胞中胰岛素样生长因子-1受体基因的转录和表达，从而促进人乳腺癌MCF-7细胞的增殖。本研究旨在检测MT1 和Sp1 在乳腺癌组织中的表达及其相关性，探讨两者在乳腺癌的发生发展过程中可能的作用机制，为乳腺癌恶性程度的判断和预后评估提供一定的依据。

1 材料与方法

1.1 标本和资料来源

收集2011年1月至2012年6月在镇江市第一人民医院行乳腺癌根治手术的90例乳腺癌标本，50例癌旁正常乳腺组织(距癌组织5 cm 以上)，每例标本于手术取材后立即冻存于液氮中。样本均取自女性患者，年龄33 ～84 岁，平均53.6 岁，所有患者术前均未接受放、化疗及其他治疗。制备的病理切片均经两位以上副高职称的临床病理医师诊断确认。其中，乳腺浸润性导管癌68例，乳腺导管内癌22例;局部腋窝淋巴结转移41例，无转移49例。按照2003年WHO 分类标准对浸润性导管癌(根据腺腔形成、核的多形性、每10 个高倍视野的核分裂相计数)进行诊断和分级，其中Ⅰ级17例，Ⅱ级32例，Ⅲ级41例。

1.2 主要试剂

兔抗人MT1 多隆抗体(bs-0027R)购自北京博奥森生物技术有限公司，工作液浓度为1 ∶100;兔抗人Sp1 多克隆抗体(No. SC-59 )和β-肌动蛋白购自美国Santa Cruz 公司，工作液浓度为1 ∶150。蛋白预染标准参照物购自美国Fermenta 公司，SP免疫组织化学试剂盒购自福州迈新试剂公司，RIPA 组织裂解液、DAB 显色剂购自武汉博士徳公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫组织化学SP 法 所有标本进行常规固定、脱水、透明、石蜡包埋，然后3 μm 连续切片、脱蜡、水化，PBS 洗涤。采用高温热修复法修复抗原;分别滴加50 μL 一抗，阴性对照用PBS 代替一抗，4℃湿盒孵育过夜;PBS 洗涤;分别滴加50 μL HRP标记的二抗，室温下孵育30 min;PBS 充分洗涤;DAB 显色5 ～10 min，流水冲洗;苏木素复染、蓝化、脱水、透明、封片，在显微镜下观察并拍照。

1.3.2 蛋白质印迹 取液氮中保存的乳腺癌组织(癌组织占所取总组织的80%以上)和癌旁正常乳腺组织，用RIPA 组织裂解液提取细胞总蛋白，蛋白定量后分装样品，于-80 ℃保存。每例标本取总蛋白20 μg，加5 μL 蛋白预染标准参照物作为标准参照，经10%SDS-PAGE 电泳分离后电转移至PVDF膜，观察预染标准参照物的转移效果，判断样品的转移效果，ECL 化学发光试剂检测杂交信号，UPV 扫描仪扫描成像。

1.4 结果判断

MT1 蛋白主要定位于细胞质或细胞膜，Sp1 蛋白主要定位于细胞核，出现黄色或棕黄色颗粒为阳性。在光镜下观察，按阳性细胞所占比例及分布情况记录如下:阴性(-)，即所有细胞中均没有染色;弱阳性(+)，即局灶性阳性着色细胞数＜10%;中度阳性(++)，即阳性着色细胞数为10% ～50%;强阳性(+++)，即阳性着色细胞数≥50%。

1.5 统计学分析

应用SPSS 16.0 软件对数据结果进行χ2检验和方差分析以及Pearson 相关性检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MT1、Sp1 在乳腺癌组织及癌旁正常乳腺组织中的表达

蛋白质印迹结果显示，乳腺癌组织、癌旁正常乳腺组织均表达MT1、Sp1 蛋白，且乳腺癌中MT1、Sp1蛋白的表达均高于其在癌旁正常乳腺组织中的表达(图1)，每组实验均重复3 次，与免疫组织化学结果一致(图2)。

图1 蛋白质印迹法检测MT1 和Sp1 在不同乳腺组织中的表达Fig 1 Western blotting results of MT1 and Sp1 expressions indifferent breast tissues

MT1 在乳腺癌组织和癌旁正常乳腺组织中的阳性表达率分别为64. 4% (58/90)，22. 0% (11/50)，两者比较差异有统计学意义(P＜0.01)。Sp1在乳腺癌组织和癌旁正常乳腺组织中的阳性表达率分别为74.4%(67/90)，28.0%(14/50)，两者比较差异有统计学意义(P＜0.01)。见表1。

2.2 MT1、Sp1 的表达水平与乳腺癌临床病理特征的关系

乳腺癌组织中MT1、Sp1 的表达与患者年龄、肿瘤大小及组织学分级无明显相关性(P＞0.05)，而与肿瘤浸润、淋巴结转移及TNM 分期有关(P＜0.05)，见表2。

图2 免疫组织化学法检测MT1 和Sp1 在不同乳腺组织中的表达(SP×200)Fig 2 Immunohistochemistry analysis of the expressions of MT1 and Sp1 in breast tissues

表1 乳腺癌组织及癌旁正常乳腺组织中MT1 和Sp1 的表达Tab 1 The expressions of MT1 and Sp1 in breast cancer tissues and adjacent normal breast tissues

表2 MT1、Sp1 的表达与乳腺癌临床病理特征的关系Tab 2 The relationship between expressions of MT1 and Sp1 and clinicopathologic characteristics of breast cancer

2.3 乳腺癌组织中MT1、Sp1 表达的相关性

经Spearman 相关性分析，乳腺癌组织中MT1与Sp1 的表达呈正相关(r=0.523，P＜0.01)。见表3。

表3 乳腺癌组织中MT1 与Sp1 表达的相关性Tab 3 The correlation of MT1 and Sp1 expressions in breast cancer tissues

3 讨论

褪黑素受体为G 蛋白偶联受体，在人体内主要有MT1 和MT2 亚型，其功能尚不完全明确。MT2主要调节昼夜节律、血管舒张、机体免疫等功能，MT1 主要调节生殖、代谢、血管收缩、肿瘤细胞增殖等功能［6]。本研究结果显示，MT1 在癌旁正常乳腺组织中低表达(22. 0%)，在乳腺癌组织中高表达(74.4%)，两者比较差异有统计学意义(P＜0.01)。MT1 在乳腺癌组织中，大多呈强阳性表达，而在癌旁正常乳腺组织中，表达全部呈阴性或弱阳性。该现象表明，MT1 编码基因在乳腺癌的发生过程中可能被激活，从而呈高表达。本研究还显示，MT1 在乳腺癌组织中的表达与肿瘤大小、患者年龄、组织学分级无明显相关性(P＞0.05)，而与肿瘤浸润、淋巴结转移及TNM 分期呈正相关(P＜0.05)，可见乳腺癌生物性越活跃，MT1 表达程度越强，这可能与MT1 调节恶性肿瘤增殖有关［7]。Dillon 等［8]研究MT1 在乳腺癌中的表达时发现，肿瘤恶性程度越高，MT1 表达水平越高，这与本实验结果一致。Yuan 等［9]研究发现，乳腺癌细胞中MT1 受体表达水平越高，肿瘤细胞对褪黑素敏感性越强。本研究结果显示，乳腺癌组织中MT1 的表达水平明显高于癌旁正常乳腺组织，且与肿瘤的复发或转移相关。这提示MT1 可作为乳腺癌术后风险判断指标之一，推测如果检测到乳腺癌患者肿瘤细胞中MT1 呈高表达，则提示复发或转移的风险较大，预后可能较差。同时MT1 在乳腺癌细胞中的高表达，为外源性褪黑素与乳腺癌结合提供了可供利用的靶点，为进一步研究外源性褪黑素在治疗乳腺癌中的应用提供了依据。Mao 等［10]研究也发现，褪黑素通过受体MT1 抑制乳腺癌细胞的侵袭，可能是通过特异性下调p38MAPK 通路，抑制MMP-2 和MMP-9 的表达及活化而实现的。正常人体内褪黑素的分泌水平随着年龄的增长逐渐下降［11]，MT1 的表达与褪黑素的分泌水平呈负相关，褪黑素分泌越少，MT1 表达越多［8]。此外，Karasek 等［12]研究发现，恶性肿瘤患者血清中的褪黑素水平较低。本研究中乳腺癌组织中MT1 异常高表达的原因可能是乳腺癌患者血清中褪黑素水平极低，无法与MT1 全部结合内化，从而导致MT1 异常堆积于乳腺癌细胞膜上。

Sp1 是具有锌指结构的一种核受体家族转录因子，含有A、B、C、D 4 个结构域，广泛存在于几乎所有组织的细胞核中［13]。转录因子Sp1 通过多种途径，如翻译后修饰、与其他蛋白结合等，影响其转录活性［14]。同时，Sp1 的激活与高表达促进肿瘤细胞的生长、分化和转移，可能是通过上调肿瘤转化生长因子及血管生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)等基因的表达，改善了肿瘤周围局部微环境的结果［15]。Maor 等［5]研究结果显示，Sp1 通过与ERα 相互作用，调节乳腺肿瘤细胞中胰岛素样生长因子-1 受体基因的转录和表达，从而促进人乳腺癌MCF-7 细胞的增殖。此外，Sp1 也在其他多种肿瘤组织中高表达。Jia 等［16]研究发现，Sp1 在人胰腺癌细胞中异常活化，上调了肿瘤细胞中VEGF 的表达，从而促进了肿瘤的侵袭和远处转移。Wang等［17]研究表明，胃癌组织中Sp1 的高表达与其发生发展密切相关，是胃癌患者预后不良的因素之一。本研究结果显示，乳腺癌组织中Sp1 的阳性表达率明显高于癌旁正常乳腺组织，说明Sp1 的异常表达可能在乳腺癌的发生发展中起一定促进作用。此外，Sp1 在TNM 分期Ⅲ-Ⅳ期患者中的阳性表达率高于TNM 分期Ⅰ-Ⅱ期患者(P＜0.05)，在伴有癌组织浸润和淋巴结转移患者中的阳性表达率分别高于无癌组织浸润和无淋巴结转移者(P＜0.01)，与王晓冰等［18]研究结果一致，提示Sp1 的异常表达可作为判断乳腺癌发生、侵袭和转移进程的一项分子指标。

本研究显示，乳腺癌组织中MT1 的表达与Sp1的表达呈正相关(r=0.523，P＜0.01)，表明两者在乳腺癌组织中的表达趋势相一致，提示其可能共同参与了乳腺癌的发生发展、侵袭和转移。在乳腺癌患者中，高表达的Sp1 促进乳腺癌的发生发展，而血清中低水平的褪黑素不能通过结合MT1 发挥抗肿瘤作用，于是MT1 代偿性异常高表达。在正常人体内，可能由于褪黑素与MT1 的结合激活了PKA 信号通路，通过抑制MMP-2 的表达影响了Sp1 的转录活性，从而抑制肿瘤的发生。其具体机制尚待进一步研究。

综上所述，MT1、Sp1 的异常表达可能在乳腺癌的发生发展、浸润和淋巴结转移中发挥着重要作用;检测两者在乳腺癌组织中的表达情况，可为探索乳腺癌相关的发病机制及基因靶向治疗提供一定的依据。

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