促红细胞生成素在人乳腺癌细胞株中的表达及作用

晋雯，张小容，孔令英

(福建医科大学病理学系，福建福州350004)

重组人促红细胞生成素(recombinant human erythropoietin，rh-EPO)于1986年应用于临床，主要用于肿瘤相关性贫血、镰刀形红细胞贫血、重大整形外科手术伴发贫血等疾病的治疗。但Bennett 等［1]2008年的荟萃分析显示，EPO 类药物可使静脉血栓栓塞(VTE)危险增加57%，死亡危险增加10%，但是增高的死亡危险并不能用增高的VTE 发生危险来解释。EPO 类药物影响患者生存的确切机制还不清楚。最近一些研究表明［2]，EPO 及其受体(EPO-R)在多种恶性肿瘤组织中表达，且与刺激肿瘤增殖、抑制凋亡，促进肿瘤血管形成等有关，所以EPO类药物在癌症患者应用中的安全性令人堪忧。但目前对此存在很大的争议，因此，有必要进一步研究rh-EPO 在调控肿瘤生长、血管生成和凋亡中的机制。本实验选择合适的rh-EPO 浓度作用于乳腺癌细胞，检测后者增殖、凋亡及转移等生物学行为的变化，探讨EPO、EPO-R 在乳腺癌发生发展中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

人乳腺癌MCF-7 细胞购自上海中科院细胞库，MDA-MB-231 细胞株由福建医科大学药理学实验室提供。DMEM 培养基、L-15 培养基、10%胎牛血清(Hyclone 公司);Trizol 液(Invitrogen 公司)，逆转录试剂盒(日本TaKaRa 公司)，PCR 试剂盒(北京博迈德公司)，EPO、EPO-R 引物由上海生工生物工程技术服务有限公司设计合成;兔抗人EPO 多克隆抗体(Abcam 公司)，鼠抗人EPO-R 单克隆抗体(Abcam公司);EnVision 试剂盒(迈新公司);配胶试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)，甲基噻唑蓝四氮唑盐(MTT)为Biosharp 公司产品，ELISA 试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)，rh-EPO(益比奥，沈阳三生制药有限责任公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 人乳腺癌MCF-7 和MDA-MB-231细胞均为单层贴壁细胞，在37 ℃，5% CO2环境下常规培养。MCF-7 细胞用含10%胎牛血清的DMEM 培养液培养，MDA-MB-231 细胞使用含10%胎牛血清的L-15 培养液培养，稳定传代2d 后备用。

1.2.2 免疫细胞化学检测EPO 和EPO-R 蛋白的表达 人乳腺癌MCF-7 和MDA-MB-231 细胞经细胞爬片后，采用EnVision 方法检测EPO 和EPO-R 蛋白的表达。胞质及胞膜有棕黄色颗粒为阳性。

1.2.3 蛋白质印迹法检测细胞EPO 和EPO-R 蛋白的表达 分别提取各组细胞总蛋白60 μg 行SDSPAGE 电泳，电转至PVDF 膜，5%脱脂奶粉封闭，分别加入鼠抗人多克隆一抗EPO(1 ∶1000)，兔抗人单克隆一抗EPO-R(1 ∶1000)，4 ℃孵育过夜。洗膜，加HRP 标记的羊抗兔、羊抗鼠二抗(均为1 ∶5000)，孵育2 h，洗膜后加ECL 发光液，X 线曝光显影，β-肌动蛋白作为内参照。蛋白印迹条带用SensiAnsys 软件分析。

1.2.4 MTT 比色法检测EPO 对乳腺癌细胞活性和生长的影响 将细胞密度分别为6 ×104/mL、1.5 ×105/mL，100 μL/孔的MCF-7 和MDA-MB-231 细胞，接种于96 孔板，37 ℃，5%CO2环境培养24 h。分别加入终浓度为1、10、100、200、300、400 U/mL 的rh-EPO。酶标仪测定570 nm 和630 nm 双波长光密度值(D 值)。按公式计算药物对细胞生长的增殖指数(PI):PI=实验组D 值/阴性对照D 值。

1.2.5 TUNEL 法测定乳腺癌细胞的凋亡指数 细胞核出现棕色颗粒为阳性着色。凋亡细胞计数:随机取高倍镜下5 个视野计数，阳性细胞占视野中所有细胞的百分比即凋亡指数(AI)，取均值。

1.2.6 Transwell 迁移、侵袭实验 消化收集MCF-7和MDA-MB-231 细胞，于小室上室内加入180 μL(含1 ×105个细胞)上述细胞悬液。实验组加入含rh-EPO 的无血清培养液20 μL，使其终浓度为200、300、400 U/mL，阴性对照组为无血清培养液。下室加600 μL 含10%胎牛血清的培养液，置37 ℃，5%CO2迁移实验培养24 h，侵袭实验培养48 h。Giemsa染色，显微镜下观察穿膜细胞，并随机取高倍镜下5个视野计数取均值。

2 结果

2.1 EPO 和EPO-R 蛋白的表达

乳腺癌MCF-7 细胞株和MDA-MB-231 细胞株均可见到EPO 和EPO-R 蛋白的表达，EPO 和EPO-R 蛋白的相对分子质量分别约为21000 和55000(图1)。

图1 蛋白质印迹法检测EPO 和EPO-R 蛋白的表达Fig 1 The protein expression of EPO/EPO-R examined by Western blot

细胞质和细胞膜内可见呈棕黄色或棕褐色细颗粒(图2)。

图2 EPO 和EPO-R 蛋白在两类细胞中的表达(免疫细胞化学染色×400)Fig 2 ICC staining of EPO and EPO-R from MCF-7 and MDA-MB-231 cells

2.2 EPO 对乳腺癌细胞活性和生长的影响

MTT 法检测未经rh-EPO 处理的乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231 细胞增殖活性，结果显示，MCF-7 和MDA-MB-231 细胞的增殖指数分别为1.40 ±0.28、2.52±0.59，两组差异有统计学意义(P＜0.01)，MDA-MB-231 细胞增殖速度大于MCF-7 细胞。

MTT 法检测经rh-EPO 诱导后乳腺癌MCF-7 和MDA-MB-231 细胞的增殖活性，结果显示，rh-EPO对乳腺癌细胞株MCF-7 和MDA-MB-231 均有增加细胞活性和促进增殖的效应，48 h 内影响不明显(差别无统计学意义)，48 h 后呈时间剂量依赖性(图3)，尤其以MCF-7 组明显。再结合未经rh-EPO处理的MTT 实验中已证实的MDA-MB-231 细胞增殖速度大于MCF-7 细胞，可以推断rh-EPO 对MCF-7 的作用效果强于MDA-MB-231 细胞。

图3 不同浓度rh-EPO 对MCF-7 和MDA-MB-231细胞增殖能力的影响Fig 3 The proliferation abilities of MCF-7 and MDA-MB-231 cells after exposed to rh-EPO

2.3 两种乳腺癌细胞的凋亡指数

TUNEL 检测凋亡细胞的结果显示，rh-EPO 处理MCF-7 和MDA-MB-231 乳腺癌细胞72 h 后并没有抑制两类细胞的凋亡。对照组、200 U/L 组、300 U/L 组、400 U/L 组4 组间凋亡指数差异无统计学意义(P＞0.05，表1)。

表1 两种乳腺癌细胞株各组凋亡指数Tab 1 Apoptosis index of two breast cancer cell lines

2.4 各组细胞株迁移、侵袭能力的比较

Transwell 迁移实验显示，rh-EPO 能增加MCF-7和MDA-MB-231 两种细胞株24 h 迁移的细胞数而且具有时间剂量依赖性，各组间差异均有统计学意义(P＜0.05，表2，图4)。

表2 各组迁移细胞数的比较Tab 2 Comparison of the number of migrating cells in each group

Transwell 侵袭实验显示，rh-EPO 能增加MCF-7和MDA-MB-231 两种细胞株48 h 侵袭穿过的细胞数，具有时间剂量依赖性，各组间差异均有统计学意义(P＜0.05，表3，图5)。

图4 促红细胞生成素对乳腺癌细胞迁移力的影响(Gimsa 染色×200)Fig 4 Migration abilities of MCF-7 and MDA-MB-231cells after exposed to rh-EPO

表3 各组侵袭穿过的细胞数比较Tab 3 Comparison of the number of invasion through cells in each group

图5 促红细胞生成素对乳腺癌细胞侵袭力的影响(Gimsa 染色×200)Fig 5 Invasion abilities of MCF-7 and MDA-MB-231cells after exposed to rh-EPO

3 讨论

促红细胞生成素及其受体的主要作用是调节红系的发生与发展。但是，近年多项研究报道了EPO及其受体的转录体和蛋白在许多肿瘤中也有表达，主要包括卵巢癌、前列腺癌、肾癌、舌鳞状细胞癌、脑膜瘤等［3-7]。另外，Giatromanloaki 等［8]发现EPO/EPO-R 在子宫内膜癌中高表达，且肿瘤恶性程度越高，EPO/EPO-R 表达越高。Yasuda 等［9]研究证实EPO-R 在恶性肺组织中的表达高于正常肺组织，且对肺泡上皮的转化可能具有诱导作用。然而，对于EPO 及其受体在乳腺癌组织中的表达和功能研究尚少。本实验采用RT-PCR 技术和蛋白质印迹等方法对乳腺癌细胞MCF-7 和MDA-MB-231 中EPO 和EPO-R 的表达做了初步研究。结果显示，无论在基因水平还是蛋白水平，两种细胞株中均有EPO 和EPO-R 的表达，且EPO 及EPO-R 均定位于细胞质和细胞膜。通过MTT 比色试验、TUNEL 法、Transwell 小室法观察不同浓度rh-EPO 对这两种细胞增殖、凋亡和转移能力的影响，结果提示外源性的促红细胞生成素有可能通过与EPO-R 结合作用于乳腺癌细胞，影响其生长。

本实验采用MTT 法检测rh-EPO 对乳腺癌细胞株MCF-7 和MDA-MB-231 增殖能力的影响。结果显示，48 h 后rh-EPO 在一定浓度范围(1 ～400 U/L)内可以呈时间、剂量依赖性地促进乳腺癌细胞株MCF-7 和MDA-MB-231 细胞的增殖，而48 h 内rh-EPO 对细胞的增殖促进作用不明显，无统计学意义。与Peres 等［10]报道的神经胶质瘤细胞、Mirmohammadsadegh 等［11]在黑色素瘤MV3 细胞株中的实验结果相一致，即通过肿瘤细胞体外培养的方法均观察到外源性EPO 对肿瘤细胞有促增殖的作用。然而李勇等［12]在同样的实验中，却得出相反的结论，提出EPO 没有明显的促进乳腺癌细胞株MCF-7生长和增殖作用。同样的实验方法、实验对象，却出现矛盾的结论，是否与实验室的条件、仪器的敏感性及试剂来自不同厂家或批次有关呢?此外本实验还发现，由于MCF-7 细胞自身的增殖速度弱于MDAMB-231 细胞，而加药后两株细胞的增殖率未见明显差异(P＞0.05)，说明rh-EPO 对MCF-7 细胞(雌激素依赖低转移)的作用强于MDA-MB-231 细胞(雌激素不依赖高转移)。rh-EPO 对不同乳腺癌细胞株的影响差异是否与雌激素有关还需进一步研究。

肿瘤的进行性生长及生长速度，与肿瘤细胞的生成和死亡的比例有关。肿瘤生长过程中，由于营养供应和抗肿瘤反应等因素的影响，有些肿瘤细胞会死亡，并且常以凋亡的形式发生。本实验采用TUNEL 法检测rh-EPO 作用于这两株细胞后的凋亡情况，结果表明，rh-EPO 没有抑制乳腺癌细胞MCF-7 和MDA-MB-231 凋亡的作用。Sinclair 等［13]报道rh-EPO 在神经胶质瘤细胞、肾脏嗜铬细胞瘤和心肌细胞及内皮细胞内并没有发挥抑制细胞凋亡和保护细胞的作用，这与我们的研究结果一致。而Mirmohammadsadegh 等［11]研究发现rh-EPO 可以抑制黑色素瘤细胞MV-3 的凋亡。提示在不同肿瘤细胞中rh-EPO 干扰后的病理生理作用可能存在差异，有待进一步研究。

侵袭和转移是乳腺癌细胞的两个重要的生物学特征，是瘤细胞从原发瘤脱离后向周围组织间隙和(或)远处组织运动转移的过程，包括瘤细胞穿过细胞外基质(excellular matrix，ECM)屏障、血管壁基膜(basement membrane，BM)、穿出血管壁进入宿主微环境以及肿瘤细胞的移动等环节。本研究采用Transwell法检测不同浓度rh-EPO 作用24 h 和48 h后细胞的迁移和侵袭能力。研究结果显示，rh-EPO呈剂量依赖性地增强MCF-7 细胞和MDA-MB-231细胞迁移运动能力和侵袭出聚碳酸酯膜的能力。而在MTT 实验中已证实在48 h 内rh-EPO 对细胞的增殖促进作用不明显。这说明rh-EPO 在48 h 范围内对细胞体外迁移及侵袭运动能力的促进作用不受rh-EPO 对细胞增殖活性的干扰。Abhold 等［14]用rh-EPO 作用于头颈鳞状细胞癌UMSCC-10B 和UMSCC-22B 细胞株，结果表明rh-EPO 能显著提高肿瘤细胞的增殖能力和侵袭转移能力。Lopez 等［15]以及Hamadmad 等［16]的研究均提示rh-EPO 能促进宫颈癌细胞的增殖、侵袭转移能力，与本实验结果一致。

综上所述，无论在基因水平还是蛋白水平，MCF-7 细胞和MDA-MB-231 细胞均有EPO 和EPOR 的表达，且EPO 及EPOR 均定位于细胞质和细胞膜。rh-EPO 在不影响癌细胞凋亡的情况下，呈时间剂量依赖性地提高乳腺癌细胞MCF-7 和MDA-MB-231 细胞的增殖活性，并呈剂量依赖性地增强其迁移、侵袭能力。这就提示，在使用rh-EPO 治疗恶性肿瘤的贫血过程中，rh-EPO 即可能参与了乳腺癌的侵袭和转移过程，随着病情的进展，进一步通过影响癌细胞的增殖作用来促进肿瘤生长，且这种促进肿瘤生成的作用与抑制细胞的凋亡可能无关。这也提示EPO/EPO-R 可能成为乳腺癌分子诊断的标志物和治疗的新靶标。至于rh-EPO 通过什么机制促进乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力还需进行深入的研究。

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