超声联合载量子点微泡光动力学抑制细胞增殖的体外研究

2013-05-06HAOLan

中国医学影像学杂志 2013年10期

关键词：透射电镜光敏剂微泡

郝兰 HAO Lan

赵雅静 ZHAO Yajing

王志刚 WANG Zhigang

冉海涛 RAN Haitao

宋卫香 SONG Weixiang

超声联合载量子点微泡光动力学抑制细胞增殖的体外研究

In Vitro Study of Cell Proliferation Inhibition Using Ultrasound

Combined with Photodynamic Therapy with Microbubbles Containing Quantum Dots

郝兰 HAO Lan

赵雅静 ZHAO Yajing

王志刚 WANG Zhigang

冉海涛 RAN Haitao

宋卫香 SONG Weixiang

目的以自制载量子点（QDs）乳酸/羟基乙酸共聚物（PLGA）微泡（MBQDs/PLGA）为光敏剂，超声（US）联合光动力疗法（PDT）处理人卵巢癌SKOV3细胞，研究细胞凋亡机制。材料与方法以双乳化法制备MBQDs/PLGA，采用MTT法比较QDs与MBQDs/PLGA的细胞毒活性，确定处理条件。在选择条件下处理SKOV3，行HE染色观察细胞受损情况，以流式细胞仪双染检测细胞凋亡情况。结果以PDT能量密度为180.0 J/cm2、US声强为0.5 W/cm2（1.0 MHz, 10 s）处理细胞，US-PDTMBQDs/PLGA和PDT-MBQDs/PLGA两组显微镜下可见细胞变形，细胞间失去彼此连接；透射电镜下可见致密的染色质沿核膜下聚集，有凋亡小体形成；最大细胞凋亡率为（22.17±0.38）%。结论 MBQDs/PLGA介导的PDT对SKOV3细胞具有增殖抑制作用，且低功率超声辐照因声孔效应能协同增效MBQDs/PLGA的PDT作用。

卵巢肿瘤；肿瘤细胞，培养的；超声疗法；量子点；微气泡；光化学疗法；细胞增殖；细胞凋亡；体外研究

量子点（quantum dots, QDs）具有独特的光学性能，它作为肿瘤诊疗一体化探针近年在生物学领域得到广泛研究[1]。量子点既是荧光探针，也是一种光敏剂[2]，但其生物毒性[3]阻碍了其在临床上的应用，生物可降解材料对其进行包埋可以改善其生物毒性，并提高生物相容性。光动力疗法（PDT）是一种新的肿瘤治疗方法，它利用光敏剂在人体内选择性聚集肿瘤细胞的特性，经适合波长的光源照射后产生光化学反应，从而对肿瘤细胞产生杀伤作用[4]。目前认为PDT主要是通过诱导细胞凋亡来实现杀伤肿瘤细胞的目的[5]。本实验旨在用生物可降解材料包埋量子点来改善其生物毒性，以量子点为光敏剂对人卵巢癌细胞株SKOV3进行体外光动力学损伤，探讨低功率超声[6]联合载量子点微泡光动力学抑制肿瘤细胞增殖的机制。

1 材料与方法

1.1 材料乳酸/羟基乙酸共聚物（PLGA，聚合比例为50∶50）；量子点（CdTe-MPA, 5 mg/ml，武汉大学）；四甲基偶氮唑蓝MTT（Sigma）；人卵巢癌细胞株SKOV3（重庆医科大学基础部研究所）；膜联蛋白Ⅴ（AnnexinⅤ）-PE/7-氨基放线菌素D（7AAD）凋亡检测试剂盒（天津三剑生物技术有限公司）。LED冷光光动力治疗仪（实验室改装HR-8，光斑面积10 cm×10 cm，功率100 mW/cm2）；透射电镜（Hitachi 7500，日本）；流式细胞仪（BD FACS Vantage SE，美国）。基因转染仪（工作频率1 MHz，输出功率0.1～3.5 W，探头面积1.0 cm×1.0 cm，重庆医科大学超声影像学研究所）。

1.2 方法

1.2.1 载量子点高分子微泡的制备称量100 mg PLGA，在烧杯中将其充分溶解于2 ml二氯甲烷溶剂中（作连续相），然后加入200 μl巯基丙酸修饰的水溶性量子点（CdTe-MPA, 5 mg/ml, PBS水溶液）（作分散相），声振仪声振动30 s成淡绿色乳液（W1/O微球）。将乳液（分散相）倒入10 ml 4%聚乙烯醇水溶液中（连续相），在均质机中以10 000 r/min均质分散5 min（W1/ O/W2微球）。然后在分散乳液中加入20 ml 2%异丙醇水溶液，于室温下磁力搅拌2～3 h，使微球表面固化，离心后得到淡绿色沉淀。沉淀物每次加入5 ml双蒸水以3000 r/min，多次离心洗涤，每次5min，至离心清液检测无绿荧光后，收集得到白色微球。冷冻干燥48 h后充入全氟丙烷气体，即得MBQDs/PLGA微泡冻干粉约100 mg，放入4℃冰箱中保存备用。

1.2.2 QDs和MBQDs/PLGA的细胞毒性比较用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基，放置于37℃、5% CO2细胞培养箱中培养SKOV3细胞，细胞长满培养瓶后，加入0.25%胰酶，37℃消化，加培养液吹打，传代。当细胞进入对数生长期时进行MTT实验。

SKOV3细胞悬液按每孔100 μl移入96孔培养板中，分为3组，每组6个复孔，实验组分别加入100 μl QDs（5×10-3mg/ml）、MBQDs/PLGA复溶乳液（8×1010个/ml, PBS），对照组加入PBS（pH=6），继续培养24 h，弃去上清液后，立即加入MTT（5 mg/ml）20 μl/孔，继续培养4 h，弃去培养基，每孔加二甲基亚砜200 μl振荡孵育10 min，选择490 nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光密度值OD490，实验重复3次。细胞毒性（抑制率）＝（对照组OD490-实验组OD490/对照组OD490）×100%。

1.2.3 光动力学疗法取5个96孔板，每孔加入100 μl培养24 h的SKOV3细胞，密度5×105个/ml，待细胞贴壁单层铺满孔底后，按8×104个/ml、8×108个/ml、8×109个/ml、8×1010个/ml梯度加入MBQDs/PLGA乳液200 μl/孔作为实验组；加入200 μl PBS（不含微泡）作为对照组；每组设8个复孔。细胞加入光敏剂微泡后避光培养8～12 h。弃去培养液后，每孔再加入RPMI 1640培养液100 μl，进行暗室光照处理，5个96孔板照射光能量密度分别设定为0（对照组）及6.0、42.0、 90.0、180.0 J/cm2（实验组），相应的照射时间为0、1.0、7.0、15.0、30.0 min。继续培养4 h，弃去上清液后，立即加入MTT（5 mg/ml）20 μl/孔，继续培养4 h，弃去培养基，每孔加二甲基亚砜200 μl振荡孵育10 min，选择490 nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光密度值OD490，测定细胞存活率，确定PDT处理条件。细胞存活率=（实验组OD490/对照组OD490）×100%。

1.2.4 低功率超声辐照联合光动力学疗法根据文献[6,7]及本课题组研究经验，选择声强为0.5 W/cm2，10 s进行超声辐照。取24孔板，每孔加入200 μl培养24 h的SKOV3细胞（密度103～104个/ml），分为6组：对照组、US（声辐照）、MB组（微泡）、US-MB组（声辐照微泡）、PDT-MB组（光照微泡）及US-PDT-MB组（声辐照后光照微泡），每组设3个复孔，细胞贴壁后，MB组、US-MB组、PDT-MB组及US-PDT-MB组各孔加入8×109个/ml MBQDs/PLGA乳液300 μl，避光培养8～12 h。弃去培养液后，每孔再加入RPMI 1640培养液200 μl，进实验室暗室处理，首先行超声辐照（0.5 W/cm2, 10 s）US组、US-MB组和US-PDT-MB组：培养板底面涂抹耦合剂，探头经下方进行辐照。然后行光照射（蓝光，410 nm，100 mW/cm2, 30 min）PDT-MB组和US-PDT-MB组进行以下处理：培养板去盖直接照射，不需照射的组别用双层锡纸保护。处理后的24孔板各组转移到96孔板，每组设5个复孔，置孵箱中继续培养8 h，弃去上清液后，立即加入MTT（5 mg/ml）20 μl/孔，继续培养4 h，弃去培养基，每孔加入二甲基亚砜200 μl振荡孵育10 min，选择490 nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光密度值OD490。测定细胞存活率。

1.2.5 透射电镜观察细胞形态变化根据1.2.3及1.2.4实验确定的条件（微泡浓度8×109个/ml；声辐照0.5 W/cm2，10 s；光照100 mW/cm2, 30 min），同法处理5组细胞（24孔板，设3个复孔）。处理后各组细胞孵育12 h，吸弃原培养液，PBS洗1次，消化收集悬浮细胞至15 ml离心管中，加入PBS，800 r/min离心5 min，吸弃上清液，加入PBS 1 ml重新悬浮细胞后转移至1.5 ml EP管中，800 r/min离心5 min，吸弃上清液，沿管壁加入1 ml 4%戊二醛覆盖细胞，置入4℃冰箱固定1～2 h后进行透射电镜观察。

1.2.6 流式细胞仪检测细胞凋亡同1.2.5操作，处理后的5组细胞孵育12 h后收集上清液；胰酶充分消化并收集细胞，1000 r/min离心10 min，弃去上清液，PBS洗涤细胞2次后，加入收集的上清液，收集细胞，然后加入冰双染试剂结合缓冲液100 μl冲洗细胞，离心除去结合缓冲液。用结合缓冲液悬浮细胞均匀后加入5 μl AnnexinⅤ-PE，室温孵育10 min后加入5 μl 7AAD染液，混匀后避光室温反应5 min，PBS洗涤1次后加入200 μl结合缓冲液，用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。AnnexinⅤ-PE（+）/7AAD（-）为凋亡细胞；AnnexinⅤ-PE（+）/7AAD（+）为坏死细胞，AnnexinⅤ-PE（-）/7AAD（-）为存活细胞。

1.3 统计学方法采用SPSS 17.0软件，细胞抑制率、存活率和凋亡率多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD 法，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MBQDs/PLGA表征自制MBQDs/PLGA冻干粉在PBS中复溶性好，形态圆整、粒径大小均匀，MBQDs/PLGA微泡与QDs光学活性基本一致，发射波长为550 nm（图1）。

图1 A.倒置荧光显微镜下MBQDs/PLGA形态圆整、粒径大小均匀；B. QDs（箭）和MBQDs/PLGA（箭头）荧光发射光谱

2.2 MBQDs/PLGA细胞毒性检测在同样条件下，量子点包裹在微泡内明显改善了量子点的细胞毒性，差异有统计学意义（t=21.644, P＜0.05）。PDT实验均以MBQDs/PLGA微泡为光敏剂进行。见表1。

表1 QDs和MBQDs/PLGA的SKOV3细胞毒性比较（n=6）

2.3 光动力学实验条件的确定图2提示：①本实验条件下细胞存活率与光能量密度和光敏剂微泡浓度均有一定的量效关系，②单纯LED冷光光照对细胞无损伤而能激活细胞增殖能力；延长辐照时间，细胞存活率轻度提高；③MBQDs/PLGA存在时，随着光照时间延长，细胞存活率均呈减小趋势，且光照15 min和30 min组间差异有统计学意义（t=17.331, P＜0.05）；随着微泡浓度增加，各组细胞存活率呈减小趋势，不同浓度各组比较，差异有统计学意义（F=76.166、218.268, P＜0.05），但8×109个/ml和8×1010个/ml组间比较，差异无统计学意义（t=3.932, P＞0.05）；而8×108个/ml和8×109个/ml组间比较，差异有统计学意义（t=9.120, P＜0.05）。因此，选择光敏剂微泡浓度为8×109个/ml、光辐照时间30 min（180.0 J/cm2）为后续实验条件。

图2 光照时间和光敏剂微泡浓度对SKOV3细胞存活率的影响

2.4 超声联合光动力学疗法由表2可见：①单纯US对细胞存活率影响不显著；②US促进了光敏剂微泡与细胞的毒性作用，MBQDs/PLGA与US-MBQDs/PLGA两组对细胞存活率的影响差异有统计学意义（t=5.850, P＜0.05）；③US明显的增强了PDT对细胞的增殖抑制作用，USPDT-MBQDs/PLGA组较PDT-MBQDs/PLGA组细胞存活率显著减小，差异有统计学意义（t=4.191, P＜0.05）。

2.5 细胞形态学变化透射电镜下可见，处理后的PDT-MBQDs/PLGA组和US-PDT-MBQDs/PLGA组细胞表面微绒毛减少或消失，细胞基质电子密度加深，核仁消失，胞质内的细胞器可见，数量减少，胞质浓缩，核内染色质密集，并裂解成小块，边集于核膜下。凋亡晚期细胞崩解为碎块，有结构不清的膜状物包裹，细胞器密集压缩，形成凋亡小体。对照组和微泡组MBQDs/PLGA在放大7000倍时包膜完整，核畸形，单核或着多核，富含染色质，电子密度均匀，细胞呈恶性肿瘤细胞特征，无凋亡小体形成。见图3。

图3 低功率超声联合光敏剂微泡光动力学疗法对SKOV3细胞形态的影响。A.对照组透射电镜下见细胞表面微绒毛清晰，包膜完整，单核，细胞相连（×7000）；B. MBQDs/PLGA组透射电镜下微绒毛可见，包膜完整，多核，细胞基质电子密度均匀（×7000）；C. USMBQDs/PLGA组透射电镜下见微绒毛减少，核畸形，细胞基质电子密度加深（×7000）；D. PDT-MBQDs/PLGA组透射电镜下见绒毛消失，线粒体肿胀，细胞基质电子密度加深，核固缩凝聚（×10 000）；E. US-PDT-MBQDs/PLGA组透射电镜下见无绒毛，核内染色质凝聚于边界，细胞器呈片状脱落，凋亡小体形成（×12 000）

2.6 流式细胞仪检测细胞凋亡率流式细胞术双参数散点图（图4）显示，US-PDT-MBQDs/PLGA组细胞凋亡率为（22.17±0.38）%。PDT-MBQDs/PLGA组细胞凋亡率为（9.24±0.13）%，对照组凋亡率仅为（0.57±0.01）%，而MBQDs/PLGA组凋亡率为（4.33±0.21）%，US-MBQDs/PLGA组凋亡率为（4.50±0.20）%，MBQDs/PLGA组与US-MBQDs/PLGA组细胞凋亡率比较，差异无统计学意义（t=0.620, P＞0.05）。

图4 流式细胞仪检测低功率超声联合光敏剂微泡光动力学疗法对SKOV3细胞凋亡率的影响。A.对照组；B. MBQDs/PLGA组；C. USMBQDs/PLGA组；D. PDT-MBQDs/PLGA组；E. US-PDT-MBQDs/PLGA组

3 讨论

本研究结果显示，载量子点微泡光动力疗法是通过诱导肿瘤细胞凋亡来实现杀伤肿瘤细胞的作用，与Carron等[2]的研究结果一致。实验用光照能量密度180.0 J/cm2处理细胞，光照条件远高于量子点纳米微粒为光敏剂的报道[8]，但实验中并未观察到凋亡到死亡过程，提示光敏剂微泡浓度偏低（有效光敏剂量不足），不能令PDT达到最大化。量子点装载于微泡核内，改善了其细胞毒性，但也阻碍了量子点对光的吸收，进一步影响了活性氧的产生及释放。本实验发现，PDT处理MBQDs/PLGA后检测到活性氧的实验不能重复，也说明目前的实验条件未能使MBQDs/PLGA光动力学治疗达到最大化。低功率超声辐照明显增强了载量子点微泡的PDT作用，其可能机制为：①超声辐照引起的声孔效应改善了细胞膜的通透性，增强了细胞对外界纳米粒子的胞吞作用；②超声辐照载量子点微泡，提高了量子点光敏剂的释放率，有利于光敏剂充分吸收光子能量，产生足量的活性氧作用于细胞而增强细胞的损伤程度；③超声辐照微泡[9]以其破碎产生的生物学效应与PDT作用协同损伤细胞。Wyld等[10]研究发现，对于某种固定的光敏剂，细胞死亡的方式从凋亡到坏死是与PDT剂量相关的。需进一步深入研究以提高量子点在微泡中的携载量，优化更佳的光照时间，而用低功率聚焦超声[11]靶向辐照载光敏剂微泡来提高量子点在肿瘤靶细胞中的释放，从而使超声联合PDT协同效应达到最大化是下一步的研究思路。

包埋量子点微泡造影剂为荧光和超声双功能成像剂[12]，量子点装载于微泡核内可以作为光敏剂。量子点因其优良的光学活性和PDT作用，在肿瘤分子水平成像与靶向治疗研究中受到广泛关注，而微泡作为成像造影剂和药物载体也受到广泛关注。超声联合载光敏剂微泡光动力学协同抑制肿瘤细胞增殖研究为推进光敏剂在临床前的研究和应用奠定了一定的基础。

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（责任编辑张春辉）

PurposeTo explore the apoptosis mechanism of human ovarian cancer cells SKOV3 processed with ultrasound (US) combined with photodynamic therapy (PDT), with self-contained lactic acid/glycolic acid (PLGA) microbubbles (MBQDs/PLGA) containing quantum dots (QDs) as a photosensitizer.Materials andMethodsMBQDs/PLGAwas prepared with double emulsion method, and MTT was used to compare the cytotoxic activity difference between QDs and MBQDs/PLGA, to determine the proper treatment condition. SKOV3 cells were treated under selective conditions, cell damage manifestation was observed with HE staining, and double staining flow cytometry was used to detect cell apoptosis.ResultsWhen cells were treated with PDT with energy density of 180.0 J/cm2and US with sound intensity of 0.5 W/cm2(1.0 MHz, 10 s), cell deformation could be observed under a microscope in both US-PDT-MBQDs/PLGAgroup and PDT-MBQDs/PLGAgroup, and cell connections were absent between cells; transmission electron microscope showed dense chromatin gathered along the nuclear membrane, with the formation of apoptotic bodies also be displayed. Maximum apoptosis rate was (22.17±0.38)%ConclusionMBQDs/PLGA-mediated PDT contains proliferation inhibition effect for SKOV3 cells, which can be synergied with low-power ultrasonic irradiation due to sonoporation effect.

Ovarian neoplasms; Tumor cells, cultured; Ultrasonic therapy; Quantum dots; Microbubbles; Photochemotherapy; Cell proliferation; Apoptosis; In vitro

重庆医科大学超声影像学研究所重庆400010

王志刚

Institute of Ultrasonic Imaging, Chongqing Medical University, Chongqing 400010, China

Address Correspondence to: WANG Zhigang

E-mail: wzg62942443@163.com

R-33；R445.1

2013-01-05

修回日期：2013-09-26

中国医学影像学杂志

2013年第21卷第10期：729-732，736

Chinese Journal of Medical Imaging