家兔下腔静脉血栓99Tc m -膜联蛋白Ⅴ显像的实验研究

吴大勇 WU Dayong

张文艳 ZHANG Wenyan

边艳珠 BIAN Yanzhu

胡玉敬 HU Yujing

家兔下腔静脉血栓99Tc m -膜联蛋白Ⅴ显像的实验研究

吴大勇 WU Dayong

张文艳 ZHANG Wenyan

边艳珠 BIAN Yanzhu

胡玉敬 HU Yujing

目的探讨99Tcm-膜联蛋白Ⅴ（Annexin Ⅴ）进行静脉血栓显像及鉴别新鲜与陈旧静脉血栓的可行性。材料与方法将15只家兔随机平均分为新鲜血栓组、陈旧血栓组及对照组，每组5只，新鲜血栓组及陈旧血栓组通过手术于下腔静脉置入螺旋铜丝建立下腔静脉血栓模型，对照组建立模型后不在下腔静脉内置入铜丝。新鲜血栓组及对照组于术后1 d、陈旧血栓组于术后14 d注射99Tcm-Annexin Ⅴ，分别于注射后30、60、90 min及2 h显像，勾画感兴趣区，计算新鲜血栓组及陈旧血栓组血栓与本底放射性计数比值，对照组计算与血栓组血栓对应的下腔静脉部位与本底放射性计数比值，比较新鲜血栓组与陈旧血栓组、对照组血栓与本底放射性计数比值的差异。显像结束后处死实验兔，留存血栓标本行病理检查。结果新鲜血栓组5只实验兔血栓部位均呈放射性浓聚影，陈旧血栓组5只实验兔血栓部位均未见放射性浓聚表现，对照组5只实验兔下腔静脉均未见放射性浓聚；新鲜血栓组血栓与本底放射性计数比值（4.06±0.49）高于陈旧血栓组（2.46±0.38）及对照组对应的下腔静脉部位与本底放射性计数比值（2.27±0.24）（t=5.746、7.318, P＜0.05）；新鲜血栓组血栓病理结果提示为新鲜混合血栓，陈旧血栓组血栓为机化混合血栓。结论99Tcm-Annexin Ⅴ有望成为一种新的急性新鲜静脉血栓显像剂用于鉴别新鲜与陈旧静脉血栓。

静脉血栓栓塞；腔静脉，下；体层摄影术，发射型计算机，单光子；有机锝化合物；膜联蛋白质类；造影剂；疾病模型，动物；兔

深静脉血栓形成（deep venous thrombosis, DVT）是导致肺动脉血栓栓塞（pulmonary thromboembolism, PTE）的主要原因，51%～71%的下肢DVT可能会发生PTE[1]。然而，PTE缺乏典型的临床表现，其漏诊率及病死率高，约60%的致死性PTE患者被漏诊[2]。急性深静脉血栓为新鲜混合血栓，其中白色血栓富含活化血小板，活化后的血小板膜表面暴露磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine, PS）[3]，膜联蛋白Ⅴ（Annexin Ⅴ）能够特异性地结合PS[4]。形成时间较长的深静脉陈旧血栓发生机化，活化血小板数量明显减少。本实验利用99Tcm-Annexin Ⅴ分别对家兔新鲜及陈旧下腔静脉血栓模型进行显像，探讨其进行急性新鲜静脉血栓显影及用于鉴别新鲜与陈旧静脉血栓的可行性。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 GE Millennium VG Hawkeye SPECT仪，CAPINTEC CRC-15R型活度仪，北京原子高科提供钼锝发生器。Annexin Ⅴ（Bender Medsystems公司），分析纯氯化亚锡（天津市化学试剂三厂），新华1号滤纸、硅胶快速层析滤纸（北京师范大学化学院惠赠），分析纯丙酮（天津市富宇精细化工有限公司）。

1.2 实验动物 清洁级新西兰家兔15只（购自河北医科大学实验动物中心，合格证号1009032），清洁环境饲料喂养，体重2.0～2.5 kg，平均（2.25±0.25）kg，雌雄不限。将15只实验兔随机平均分为新鲜血栓组、陈旧血栓组及对照组，每组5只。

1.399Tcm-Annexin Ⅴ标记 参照文献[5]报道的方法，在反应瓶中依次加入30 μg Annexin Ⅴ、500 μl柠檬酸葡萄糖溶液、10 mg/ml酒石酸钾钠溶液100 μl、10 μl新鲜SnCl2/HCl（2 mg/ml）溶液，充分摇匀，于4℃冰箱冷藏静置20 min，然后向反应瓶中加入1 ml高锝酸钠（99TcmO4-）溶液（1110 MBq/ml），室温下静置20 min，完成标记。利用双体系[新华1号滤纸为固定相、丙酮为展开剂，硅胶快速层析滤纸（ITLG-SG）为固定相、生理盐水为展开剂]测定99Tcm-Annexin Ⅴ标记即刻、室温及37℃恒温箱下保存1、2、3、4、5、8 h放化纯。

1.4 家兔下腔静脉血栓模型制作 参照文献[6]报道的方法，家兔经耳缘静脉注射3%戊巴比妥钠（1.0～1.3 ml/kg）麻醉，将麻醉好的家兔固定在手术台上，右侧腹备皮，于右侧腹部皮肤切开一4～6 cm长切口，钝性分离肌肉及腹膜，暴露右肾下极以远长约4 cm的下腔静脉，将自制长约3 cm、直径约2 mm的单股螺旋铜丝穿刺置入下腔静脉，自制铜丝U形夹于下腔静脉近心端卡住螺旋铜丝，止血、缝合血管，查看下腔静脉通畅后，缝合肌肉、皮肤。对照组家兔建立下腔静脉血栓模型后，下腔静脉不置入螺旋铜丝。术后肌肉注射80万U青霉素，家兔于清洁环境饲养。

1.5 显像方法与图像分析 新鲜血栓组与对照组家兔于术后1 d、陈旧血栓组于术后14 d进行99Tcm-AnnexinⅤ显像。各组实验兔于注射后30、60、90、120 min行静态平面显像。实验兔仰卧于检查床上，SPECT仪配低能高分辨准直器，采集能峰：140 keV，窗宽20%。共采集1000K计数，矩阵256×256，放大2倍。血栓显影的实验兔于血栓显影最清楚的时间点图像勾画血栓部位和右后肢根部（作为本底）等面积感兴趣区（ROI），未显影实验兔于60 min显像图像勾画血栓部位和右后肢根部（作为本底）等面积ROI，计算静脉血栓部位与本底放射性计数比值。对照组实验兔于60 min显像图像，在与血栓组血栓对应的下腔静脉部位勾画ROI，于右后肢根部勾画等面积的ROI作为本底，计算对应下腔静脉部位与本底放射性计数比值。

1.6 病理检查 显像完毕后处死实验兔，新鲜血栓组及陈旧血栓组实验兔取血栓，用生理盐水冲洗干净，纱布沾干，置于福尔马林溶液中固定，然后行HE染色。

1.7 统计学方法 采用SPSS 17.0软件，新鲜血栓组与陈旧血栓组、对照组血栓与本底放射性计数比值比较采用独立样本t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.199Tcm-Annexin Ⅴ放化纯99Tcm-Annexin Ⅴ在标记即刻、室温及37℃恒温保存2 h内放化纯均高于95%，保存8 h仍高于90%。

2.2 显像结果 新鲜血栓组5只实验兔下腔静脉血栓部位均可以观察到团状放射性浓聚影（图1），血栓开始显影的时间为30～60 min，均为逐渐增浓之后减淡。陈旧血栓组实验兔血栓部位及对照组实验兔下腔静脉走行区均未见放射性浓聚（图2）。新鲜血栓组血栓与本底放射性计数比值（4.06±0.49）高于陈旧血栓组（2.46±0.38）及对照组对应的下腔静脉部位与本底放射性计数比值（2.27±0.24），差异有统计学意义（t=5.746、7.318, P＜0.05）。

2.3 解剖及病理结果 新鲜血栓组实验兔解剖后肉眼均可见下腔静脉内血栓形成，血栓附着于铜丝上，呈红白相间（图3A）；血栓病理显示均为新鲜混合血栓，显微镜下可见珊瑚状淡红色血小板小梁，红细胞分布于小梁间的纤维素网内，小梁边缘黏附有较多的中性粒细胞（图3B）。陈旧血栓组实验兔解剖后肉眼亦均可见血栓形成，血栓沿螺旋铜丝红白相间，但较新鲜血栓组血栓颜色偏暗（图3C）；血栓病理显示均为陈旧机化的混合血栓，显微镜下见珊瑚状血小板小梁，小梁间隙可见多量内皮细胞分化趋势细胞，小梁间的纤维素网内包含少量红细胞及较多附着的中性粒细胞，呈机化表现（图3D）。对照组解剖后下腔静脉内未见血栓形成。

图1 新鲜血栓组显像。血栓部位呈放射性浓聚影（箭），逐渐增浓后减淡，注射99Tcm-Annexin Ⅴ后60 min显影最清晰。A～D分别为注射99Tcm-Annexin Ⅴ后30、60、90、120 min显影

图2 陈旧血栓组与对照组显像（60 min）。A.陈旧血栓组血栓部位未见放射性浓聚；B.对照组下腔静脉未见放射性浓聚

图3 A、B.新鲜血栓组血栓肉眼（A）及病理镜下（B）所见，病理示混合血栓，未见机化表现（HE, ×40）；C、D.陈旧血栓组血栓肉眼（C）及病理镜下（D）所见，病理示血栓小梁间隙可见多量血管内皮细胞分化趋势细胞，呈机化表现（HE, ×40）

3 讨论

PTE的血栓主要来源于DVT，而PTE的高病死率严重威胁着人类的健康。在西方国家，DVT和PTE的每年发病率分别为0.1%和0.05%[7]。急性静脉血栓主要为新鲜混合血栓，其中混合血栓内的白色血栓部分富含活化的血小板；而形成时间较长的静脉陈旧混合血栓多发生机化，血栓内活化的血小板明显减少。新鲜静脉血栓较陈旧机化血栓脱落的风险更大，因此对于急性新鲜静脉血栓应采取积极的溶栓治疗，两者的鉴别对于临床制订治疗计划具有重要意义[8]。

根据与活化血小板结合的机制不同，血栓活化血小板显像剂主要有与GPⅡbⅢa受体结合、与P-选择素结合、与PS结合3类[9]。与GPⅡbⅢa受体结合的显像剂研究较多[10,11]。Ji等[12]利用99Tcm标记国内自行研制的P-选择素单克隆抗体SZ-51，成功地对新鲜动脉、下肢深静脉及肺动脉血栓进行显像，但多肽及单克隆抗体制备成本高，其应用受到一定的限制。与PS结合的血栓显像剂主要为99Tcm-Annexin Ⅴ，它能够与活化的血小板表面暴露的PS结合，从而实现对血栓进行显像。

本实验观察到下腔静脉造模术后1 d左右的新鲜血栓组5只实验兔99Tcm-Annexin Ⅴ显像血栓均显影，新鲜血栓组下腔静脉血栓/本底放射性计数比值为4.06±0.49，具有较高的靶本比，血栓能够清晰地显像。新鲜血栓组血栓经病理证实为新鲜混合血栓。形成时间长的静脉陈旧混合血栓多发生机化，血栓活化的血小板明显减少，血栓血小板表面暴露的PS减少。因此，陈旧静脉血栓摄取99Tcm-Annexin Ⅴ明显减少。本实验中血栓形成14 d的陈旧血栓组血栓均未见显影，血栓经病理证实为陈旧机化血栓。

99Tcm-Annexin Ⅴ用于急性左心房血栓[13]、腹主动脉瘤附壁血栓[14]、感染性心内膜炎血栓性赘生物[15]、新鲜动脉血栓[16]显像的研究已有报道，以上研究的血栓均形成于动脉血液。本实验结果显示，活化的血小板较动脉血栓少的新鲜静脉血栓利用99Tcm-Annexin Ⅴ显像能够显影。本实验所得平均血栓/本底放射性计数比值较Sarda-Mantel等[14]研究得到的大鼠腹主动脉瘤模型附壁血栓/本底放射性计数比值（SPECT: 5.7±0.9）低，可能是因为腹主动脉瘤附壁血栓形成于动脉血液，血栓内活化的血小板数量多，摄取99Tcm-Annexin Ⅴ多，而且断层显像比静态平面显像受重叠组织干扰少。同时，本实验所得平均血栓反斜线本底放射性计数比值均高于贾支俊等[17]、吕中伟等[18]报道的股动脉血栓/本底放射性计数比值（分别为3.13、3.68），可能与血栓形成的血管部位、时间长短及感兴趣区勾画部位不同有关。

99Tcm-Annexin Ⅴ实验动物活体显像中新鲜静脉血栓能够显影，且显示了良好的血栓/本底放射性计数比值，而陈旧静脉血栓未能显影，提示99Tcm-Annexin Ⅴ有望成为一种新的急性静脉血栓显像剂，用于鉴别新鲜与陈旧静脉血栓。

[1] 程显声, 何建国. 肺栓塞的流行病学. 中国循环杂志, 1998, 13(2): 65-66.

[2] Heit JA, Cohen AT, Anderson FA. Estimated annual number of incident and recurrent, non-fatal and fatal venous thromboembolism (VTE) events in the US. ASH Annual Meeting, 2005, 106(11): 910.

[3] Vriens PW, Blankenberg FG, Stoot JH, et al. The use of technetium Tc 99m annexin V for in vivo imaging of apoptosis during cardiac allograft rejection. J Thorac Cardiovasc Surg, 1998, 116(5): 844-853.

[4] Johnson LL, Schofield L, Donahay T, et al. 99mTc-annexin V imaging for in vivo detection of atherosclerotic lesions in porcine coronary arteries. J Nucl Med, 2005, 46(7): 1186-1193.

[5] Zhu L, Liu BL, Guo YZ. 99Tcm direct labeling of Annexin V for potential apoptosis imaging in vivo. J Labelled Comp Rad, 2003, (z1): S324.

[6] 季顺东, 方纬, 范磊, 等.99Tcm标记人源化抗人血小板膜糖蛋白Ⅲ a单克隆抗体SZ21F(ab)2血栓栓塞显像. 中华核医学杂志, 2007, 27(3): 173-176.

[7] Torbicki A, Van Beek ER, Charbonnier B, et al. Guidelines on diagnosis and management of acute pulmonary embolism. Task Force on Pulmonary Embolism, European Society of Cardiology. Eur Heart J, 2000, 21(16): 1301-1336.

[8] 李晓强, 王深明. 深静脉血栓形成的诊断和治疗指南(第2版). 中国医学前沿杂志(电子版), 2013, 50(3): 53-57.

[9] 吴大勇, 边艳珠. 血栓活化血小板放射性核素显像研究进展. 中国医学影像技术, 2011, 27(12): 58-61.

[10] 何嘉, 方纬, 王峰, 等.99Tcm-DMP444肺动脉血栓与下肢深静脉血栓显像的实验研究. 中华核医学与分子影像杂志, 2012, 32(1): 59-62.

[11] Fang W, He J, Kim YS, et al. Evaluation of 99mTc-labeled cyclic RGD peptide with a PEG4 linker for thrombosis imaging: comparison with DMP444. Bioconjug Chem, 2011, 22(8): 1715-1722.

[12] Ji S, Fang W, Zhu M, et al. Detection of pulmonary embolism with 99mTc-labeled F(ab)2 fragment of anti-P-selectin monoclonal antibody in dogs. Tohoku J Exp Med, 2011, 223(1): 9-15.

[13] Stratton JR, Dewhurst TA, Kasina S, et al. Selective uptake of radiolabeled annexin V on acute porcine left atrial thrombi. Circulation, 1995, 92(10): 3113-3121.

[14] Sarda-Mantel L, Coutard M, Rouzet F, et al. 99mTc-annexin-V functional imaging of luminal thrombus activity in abdominal aortic aneurysms. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2006, 26(9): 2153-2159.

[15] Rouzet F, Dominguez Hernandez M, Hervatin F, et al. Technetium 99m-labeled annexin V scintigraphy of platelet activation in vegetations of experimental endocarditis. Circulation, 2008, 117(6): 781-789.

[16] Tait JF, Cerqueira MD, Dewhurst TA, et al. Evaluation of annexin V as a platelet-directed thrombus targeting agent. Thromb Res, 1994, 75(5): 491-501.

[17] 贾支俊, 申景涛, 郭万华, 等.99Tcm标重组H-Annexin Ⅴ在动物血栓显像中的研究. 中华核医学杂志, 2007, 27(5): 291-294.

[18] 吕中伟, 朱承谟, 李彪, 等.99Tcm-Annexin血栓显像及其体内分布的初步实验研究. 上海医学影像杂志, 2000, 9(3): 137-139.

（责任编辑 张春辉）

99Tc m -Annexin ⅤScintigraphy of Inferior Vena Cava Thrombus in Rabbits

PurposeTo explore the features of99Tcm-Annexin Ⅴ scintigraphy of venous thrombus and its feasibility of discriminating fresh venous thrombus from old one.Materials andMethodsThe rabbits (n=15) were randomly divided into three groups (fresh thrombus group, old thrombus group and control group). The inferior vena cava thrombus models were developed in the rabbits of thrombus groups by inserting screw cooper wire into inferior vena cava. The rabbits of control group received sham operation.99Tcm-Annexin Ⅴ was injected in the rabbits of fresh thrombus group and control group one day after operation; the same was done in the rabbits of old thrombus group 14 days after operation. Planar anterior abdominal images were obtained at 30, 60, 90 and 120 min after99Tcm-Annexin Ⅴ injection in all groups respectively. The ratios of thrombus to background of the two thrombus groups and the ratios of the area correspondent to the thrombus groups to background of the control group were calculated by ROIs counts. Then rabbits were executed, and thrombus was used for pathology examination.Results99Tcm-Annexin Ⅴ uptake in thrombi was clearly visualized in all rabbits of the fresh thrombus group; whilst negative images showed in all rabbits of the old thrombus group and control group. The thrombus to background ratios of the fresh thrombus group (4.06±0.49) were higher than that of the old thrombus group (2.46±0.38), and also higher than the inferior vena cava below inferior pole of right kidney level to background ratios (2.27±0.24) of the control group (t=5.746, 7.318; P＜0.05). All the thrombi of the fresh thrombus group were confirmed as fresh mixed thrombi by HE staining, and those of the old thrombus group were confirmed as old mixed organized thrombi.Conclusion99Tcm-Annexin Ⅴ may become a new acute venous thrombus imaging tracer used to discriminate fresh venous thrombus from old one.

Venous thromboembolism; Vena cava, inferior; Tomography, emissioncomputed, single-photon; Organotechnetium compounds; Annexins; Contrast media; Disease models, animal; Rabbits

河北省人民医院核医学科 河北石家庄050051

边艳珠

Department of Nuclear Medicine, Hebei Genral Hospital, Shijiazhuang 050051, China

Address Correspondence to: BIAN Yanzhu

E-mail: hyx8144@126.com

河北省医学科学研究重点课题计划项目（20110224）。

R-33；R445.5

2013-06-04

修回日期：2013-09-11

中国医学影像学杂志

2013年 第21卷 第10期：725-728

Chinese Journal of Medical Imaging

2013 Volume 21(10): 725-728

10.3969/j.issn.1005-5185.2013.10.002