紫花苜蓿的组织培养与快繁技术研究

2013-04-29李云玲苗锦山

安徽农学通报 2013年7期

李云玲　苗锦山

摘要：以紫花苜蓿为材料，研究了不同外植体和不同激素处理对苜蓿愈伤和胚状体分化的影响。结果表明，子叶和下胚轴作外植体，在MS+2，4-D 2.0mg/L+NAA 1.0mg/L +BA 0.5mg/L培养基上愈伤组织诱导率较高，下胚轴的诱导率要高于子叶；下胚轴在MS+BA 3.0mg/L培养基中胚状体分化率最高。

关键词：紫花苜蓿；组织培养；快繁技术

中图分类号 Q943.1 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2013）07-51-02

目前，土壤盐渍化是影响生态环境和农业生产的严重问题。在盐胁迫下，植物代谢会受抑制，生长变得缓慢，严重时，叶子萎蔫，甚至死亡。目前，全世界的盐渍化土地约占陆地面积约30%，而在中国，盐渍地的比例明显高于世界平均水平，天津东部滨海平原区土壤盐渍化尤其严重。另外，日光温室的大面积普及使土壤盐渍化的问题也越来越明显[1]。

紫花苜蓿，豆科苜蓿属，是一种比较抗盐的作物[2]，其分布遍及五大洲，苜蓿中蛋白质含量可达80%，营养价值丰富，而且再生性强，是改良土壤的良好绿肥[2-3]，因而被称为“牧草之王”。如果能在盐碱地上种植苜蓿，既可以起到绿化作用，又可创造经济价值，还可以改良土壤，兼顾社会效益、经济效益和生态效益[4]。由于苜蓿是多年生异花授粉植物，自交结实率低，仅通过常规育种进行品种改良非常困难，而以植物遗传转化技术改良苜蓿品质是一条有效途径[5]。笔者通过研究不同外植体及不同培养基激素改变对愈伤组织形成和芽分化的影响，以期建立紫花苜蓿的快繁再生体系。

1 材料与方法

1.1 试验材料供试苜蓿品种为紫花苜蓿，由潍坊科技学院蔬菜工程技术研究所提供。

1.2 试验方法

1.2.1 无菌苗的培养将紫花苜蓿的种子流水充分洗净后，浸泡10h左右，然后放入超净工作台中。先用75%的酒精浸泡30s，然后用无菌水冲洗3次，取出后用0.1%的升汞消毒10min，再用无菌水冲洗3～5次，洗去多余的升汞。接种到MS培养基中，7～10d后种子陆续萌发、子叶展开。

1.2.2 不同激素对不同外植体愈伤诱导的比较试验以无菌苗的子叶、下胚轴和叶片为外植体，在MS基本培养基的基础上，分别附加不同浓度的生长素2，4-D、NAA和细胞分裂素6-BA、3%蔗糖、10mg/L的硝酸银、0.2%的木炭粉。每种培养基处理6瓶，每瓶接种10个外植体。培养20d后进行数据统计。

1.2.3 愈伤组织的继代培养将生长较好的愈伤组织转入继代培养基中继续培养，继代培养15d后进行分化实验。

1.2.4 不同激素对愈伤组织分化的比较试验将愈伤组织阶段生长了15d左右的愈伤组织，转入分化培养基中进行培养。在MS基本培养基的基础上，分别附加不同浓度的生长素NAA、细胞分裂素6-BA、KT、3%蔗糖和0.2%的木炭粉。每种培养基处理6瓶，每瓶接种5块愈伤组织，培养25d后进行数据统计。

2 结果与分析

2.1 不同外植体对诱导紫花苜蓿愈伤组织的影响由表1可知，在M1～M4 4种培养基中，下胚轴的愈伤组织诱导率均在90%以上，子叶的诱导率也较高，在75%以上，两者在M1培养基中的愈伤诱导率均可达到100%，而在M5中，两者诱导率都比较低。叶片在5种培养基中的愈伤诱导率都很低。

从形成的愈伤组织形态来看，下胚轴和子叶形成的愈伤组织质地密实，颜色为绿色，表面有细小突起，后期分化能力较强；而叶片形成的愈伤组织，颜色为黄白色，水浸样，松软粘连，难以继代，后期分化能力很差。将子叶和下胚轴生成的愈伤组织转入继代培养基中培养，培养基为M1，15d后观察，愈伤组织体积增大，利于进行分化培养。

2.2 不同激素处理对苜蓿愈伤组织形成的影响由表1可知，无论是子叶还是下胚轴，随生长素2，4-D和NAA浓度的增加，愈伤形成率也越来越高。这表明生长素对于愈伤的形成作用明显，是愈伤组织形成的主要因素。细胞分裂素6-BA的浓度也影响愈伤组织的诱导率，随6-BA浓度的升高，愈伤组织诱导率也会越高。2，4-D，NAA和6-BA在本次试验的浓度范围内，愈伤组织诱导率均随彼此浓度的增加而增加。

2.3 不同激素对苜蓿胚状体分化的影响将诱导出的下胚轴愈伤组织进行继代培养，15d后转移到表2中所列4种培养基中进行培养，结果如表2。可以看出，细胞分裂素对苜蓿分化率有着较重要的作用。随6-BA浓度的增加，胚状体的分化率也越高；可选用添加了BA2.0～3.0mg/L的MS培养基进行胚状体诱导。在培养基中同时加入生长素时，分化率反而下降。分化成功的胚状体经过约25d后，可以在培养基上生成小苗。

3 讨论与小结

实验发现，在愈伤组织及胚状体分化的培养基中加入硝酸银及木炭粉，接种的外植体褐变程度会减轻，并且有助于形成的愈伤组织结构致密，颜色发绿，有突起，容易形成胚状体。这一结果与朱海军等[6]、杜何为等[7]的研究是一致的。

从实验结果可以看出，不同类型的外植体会对愈伤组织的诱导产生影响。子叶和下胚轴均可作为外植体再生，但是下胚轴相比子叶而言，其具有更短的愈伤组织诱导时间、更高的诱导率和胚状体分化率，这与其他研究者得到的结论相一致[8-9]，因此在下一步实验中可以把下胚轴作为紫花苜蓿组织培养首选的外植体。

参考文献

[1]盛学斌.大渤海区海水入侵态势与防治构想[J].生态学报，1996，16（4）：418-426.

[2]武之新，翟玉柱，杨连台，等.滨海盐渍土壤苜蓿保苗技术的研究[J].草业科学，1994，11（6）：61-63.

[3]刘文辉.陇东紫花苜蓿的经济性状及其发展前景的研究[J].草业科学，1992，9（3）：7l-72.

[4]田瑞娟，刘艳军，杨静慧，等.不同激素不同外植体对苜蓿品种再生的影响[J].南方农业，2007，3（1）：13-14.

[5]马海燕，张博，郝兴明，等. 苜蓿高效再生体系研究进展[J].草业科学，2005，22（11）：30-33.

[6]朱海军，俞红强，义鸣放. 蓝刺头组织培养和叶片再生植株的研究[J].核农学报，2007，21（6）：581-584.

[7]杜何为，许先凤，黄敏，等. 硝酸银对玉米幼胚组织培养的影响[J].河北农业科学，2008，12（8）：62-63.

[8]危晓薇，蔡丽娟，李仁敬.紫花苜蓿组织培养及其再生植株[J].新疆农业科学，1999（2）：73-75.