Zn2+对基因工程大肠杆菌P84A/MC1061发酵生产卤醇脱卤酶的影响

潘冬瑞　李啸　张瑶　李知洪　俞学锋

摘 要：主要研究Zn2+对基因工程大肠杆菌发酵生产卤醇脱卤酶的影响。以卤醇脱卤酶活力为响应值，通过单因素试验筛选出显著影响因子Zn2+，并确定其最优浓度为0.000 7 g·L-1；在50 L罐中进行分批发酵试验，比较分析卤醇脱卤酶活力、OD600以及在线参数OUR、CER等的变化趋势，发现Zn2+可显著促进重组大肠杆菌生长，提高生长速率，酶活提高了5.4%。

关键词：卤醇脱卤酶；锌离子；大肠杆菌；发酵调控

中图分类号：R378.2+1 文献标识码：A DOI编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2013.08.002

卤醇脱卤酶也叫卤醇-卤化氢裂解酶，通过分子内亲核取代机制催化邻卤醇转化为环氧化物和卤化氢，是微生物降解此类化合物的关键酶之一，在治理环境污染方面具有十分重要作用。此外，在催化环氧化物和邻卤醇之间的转化反应中，卤醇脱卤酶具有很高的立体选择性，因而在手性药物合成方面也有广阔的应用前景。序列同源性搜索以及二级、三级结构预测表明，卤醇脱卤酶的结构相似于短链脱氢酶/还原酶家族（SDRs），它的3个重要的催化残基分别是：L-Tyr145、L-Ser132和L-Arg149[1-2]。卤醇脱卤酶是目前世界范围内的一个新的研究领域，目前的研究均仅限于卤醇脱卤酶基因的改造和优化，对于大肠杆菌发酵生产卤醇脱卤酶的影响因素及过程调控的研究甚少。

微生物在生长繁殖和产酶过程中，需要无机盐维持细胞的渗透压，并合成核酸等生命物质；某些微量元素如锰、锌、铁等对其生理活性物质（酶的活性中心或辅酶）的组成，或生理活性作用调节物（酶的激活剂）的作用有重要影响[3]。

关于Zn2+在生物界中重要性上的认识是个漫长的经历[4]，包括农业和畜牧业，最后在近100年来，发现在人体生长发育过程中，Zn2+在生理功能上和营养作用上具有极为重要的意义，从生命遗传物质核酸到代谢参与物—酶，都有Zn2+的作用，因而研究学者称其为“生命的火花”。但是，Zn2+在微生物代谢过程中的作用等相关研究在国内外成果不多，此方面研究有着十分重要的意义。

笔者主要对Zn2+在大肠杆菌发酵生产卤醇脱卤酶的过程进行研究，以确定影响菌体生长及卤醇脱卤酶表达的Zn2+的最优百分比，并通过多参数相关分析的方法，探究Zn2+对卤醇脱卤酶生物合成影响的原理，为后续发酵过程优化以及生产放大奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌种 重组大肠杆菌E.coli P84A/MC1061，由安琪酵母股份有限公司菌种室提供。

1.1.2 试 剂 L-阿拉伯糖L（+）-Arabinose，购于Sigma公司。酵母浸出物FM888由安琪酵母股份有限公司生产。其它试剂均为分析纯AR。

1.1.3 培养基 斜面培养基（g·L-1）：甘油8，酵母浸出物（FM888）25，NaCl 6.0，KH2PO4 2.5，K2HPO4 2.5，Na2HPO4 5.0，MgSO4·7H2O 1.0，琼脂粉15。摇瓶液体培养基（g·L-1）：甘油4，酵母浸出物50，NaCl 2.0，KH2PO4 6.5，K2HPO4 6.5，Na2HPO4 3.5，MgSO4·7H2O 1.5，微量元素2。50 L发酵罐液体培养基（g·L-1）：甘油12，酵母浸出物50，NaCl 2.0，KH2PO4 6.5，K2HPO4 6.5，Na2HPO4 3.5，MgSO4·7H2O 1.5。

1.1.4 诱导剂溶液 L-阿拉伯糖浓度0.05 g·mL-1。

1.2 培养方法

1.2.1 摇瓶培养 种子培养：将斜面菌样接入装有25 mL液体培养基的250 mL的三角瓶中，在30 ℃和200 r·min-1摇床上培养20 h。发酵培养及诱导产酶：将种子液接入发酵摇瓶后，在30 ℃，200 r·min-1条件下培养，当发酵液OD600达到2时，加入0.5 mL·L-1阿拉伯糖溶液，发酵结束后收集菌体。

1.2.2 发酵罐培养 1级种子培养：将斜面菌样接入装有25 mL液体培养基的250 mL的三角瓶中，制备2瓶，在30 ℃和200 r·min-1摇床上培养24 h。2级种子培养：将2 mL 1级种子瓶菌样，接入装有100 mL液体培养基的1 L的三角瓶中，制备6瓶，在30 ℃和200 r·min-1摇床上培养20 h。发酵罐分批发酵培养：灭菌前加入15 mL消泡油，灭菌后将6瓶2级种子液合并，接入装有30 L液体培养基的50 L发酵罐中，在30 ℃、260 r·min-1、0.035 MPa下培养，当发酵液OD600达到2时，加入配制好的L-阿拉伯糖溶液。

1.3 发酵罐调控添加策略

pdr2罐未加入Zn2+；pdr3罐配底料时加入筛选出的最优浓度（0.000 7 mol·L-1）的Zn2+。

1.4 测定项目及方法

1.4.1 测定项目：pH、OUR、CER、RQ、温度、搅拌转速、空气压力、空气流量、溶解氧等。发酵过程中每1 h测1次OD600，每2 h测1次氨基氮和铵根离子，每4 h测1次卤醇脱卤酶酶活和胞内胞外Zn2+的含量。

1.4.2 测定方法 菌体量测定方法见参考文献[5]。卤醇脱卤酶酶活力测定方法见参考文献[6]。锌离子含量测定用原子吸收法测定[7]。氨基氮测定用甲醛滴定法[8]。用靛酚蓝-分光光度法测定铵根离子[9]。

2 结果与分析

2.1 摇瓶试验

2.1.1 筛选显著影响因子 试验发现，一些微量元素对酶的生理活性物质（酶的活性中心或辅酶）的组成或生理活性作用的调节物（酶的激活剂）的作用有重要影响，基于李建华等[3]对于影响卤醇脱卤酶活力的6种金属离子：Zn2+ 、Co2+、Fe2+、Ca2+、Mn2+和Cu2+的考察，选择其中较显著的3种影响因子Zn2+、Co2+和Fe2+进行深入筛选，在离子浓度0，0.000 2，0.000 4，0.000 6，0.000 8，0.001 0，

0.001 2 g·L-1 7个浓度下比较，3种金属离子在不同浓度下的OD600与卤醇脱卤酶活力的变化趋势如图1和图2。

相对空白组而言，Fe2+、Zn2+ 和Co2+对菌体的生长都有一定程度的促进作用，但Zn2+对重组大肠杆菌的生长的促进影响更为显著（见图1），且在Zn2+ 浓度为0.000 6 g·L-1菌体浓度达到最大。另外，加Zn2+组对卤醇脱卤酶活力的提高也最为显著（见图2），Zn2+ 浓度在0.000 8 g·L-1时酶活最高。综上所述，无论是对重组大肠杆菌菌体生长，还是卤醇脱卤酶活力的影响上看，最显著影响因子为Zn2+，因此后续研究工作围绕Zn2+展开。

2.1.2 显著因子Zn2+最优浓度的确定 为进一步找到更准确的Zn2+最优浓度，接下来的研究将缩小浓度梯度，在离子浓度0，0.000 6，0.000 7，

0.000 8，0.000 9，0.001 0 g·L-1 6個浓度下比较，结果见图3。

由图3知，缩小Zn2+浓度梯度后，各试验组中0.000 7 g·L-1浓度下的Zn2+对重组大肠杆菌生长和卤醇脱卤酶活力的影响更为显著，Zn2+最优浓度为0.000 7 g·L-1。

2.2 50 L pdr2、pdr3发酵罐分批发酵结果

在50 L发酵罐中进行分批发酵试验，添加Zn2+的策略如1.3所示。

两种控制策略下重组大肠杆菌表达卤醇脱卤酶的发酵过程比较如图4、5和6所示。

由图4可知，两罐前2 h的延滞期基本相同，3～7 h pdr3 罐（在底料中加入了最优浓度的Zn2+）的生长速率明显高于pdr2罐，并在7 h达到最大菌浓。由图5知，发酵前16 h pdr3 罐的卤醇脱卤酶酶活相对于pdr2罐均有一定程度的提高，最大酶活由90 715.60提升至95 590.88，提高了5.4%，而后8 h的酶活两罐相差不大。pdr3 罐与pdr2 罐比较，其合成最大酶活所需的时间由16 h缩减至12 h。

由图6知，两罐的OUR和CER的趋势基本相似，但pdr3罐对应的呼吸强度略大于pdr2罐，代谢更为旺盛；而对于呼吸熵RQ曲线，pdr3罐的曲线可近似看做是pdr2罐对应的曲线向前平移约3 h所得。

由此推知，Zn2+通过提高重组大肠杆菌E.coli P84A/MC1061的生理活性和生长速率，同时提高其生物积累量而提高了卤醇脱卤酶的表达量。

3 结论与讨论

综合以上摇瓶试验和50 L发酵试验可知，在底料中加入Zn2+，重组大肠杆菌E.coli P84A/MC1061的生理活性和生长速率得到了明显提高，菌体的生物积累量增加，卤醇脱卤酶的表达量增加，最大酶活由90 715.60提升至95 590.88，提高了5.4%，且最大酶活表达时间提前约4 h。

关于Zn2+生物学功能方面的报道很多。从20世纪60年代开始，如Vallee B L等[10]许多科学研究已经证明：Zn2+是超过120种酶的重要组成部分，同时Zn2+也是所有生物正常细胞生长、发育和分化所不可或缺的。文献表明，Zn2+对微生物生长及代谢的影响可能有以下几种途径和方式：（1）DNA聚合酶[11]和RNA聚合酶[12]都是锌金属酶[13]，Zn2+可以决定和稳定核苷酸的信息[14-15]，从而通过改变Zn2+的含量即可影响转录和翻译。故Zn2+可通过影响DNA聚合酶和RNA聚合酶的合成，来影响蛋白质的合成和表达；（2）在糖酵解过程中，Zn2+是磷酸甘油醛脱氢酶、乙醇脱氢酶和乳酸脱氢酶的活化剂。故Zn2+可参与呼吸作用与多种物质代谢过程；（3）Zn2+和氮代谢有密切的关系。Zn2+含量的多少可以调控硝酸还原酶的活性强弱[16]，而硝酸还原酶活性的强弱会影响到氮素的利用和吸收[17]；（4）卤醇脱卤酶有3个重要的催化残基分别是：Tyr145、Ser132和Arg149[1-2]，Zn2+可以与丝氨酸关系密切的色氨酸[12]形成配合物并影响其转化过程，故Zn2+还可能通过影响卤醇脱卤酶的结构、活性中心等，从而直接影响卤醇脱卤酶活力；（5）Zn2+含量的改变使得依赖Zn2+浓度的细胞内某些金属离子（比如：锰、铁、铜）浓度的变化[18]，从而介导细胞膜发生改变，影响核酸的结构或核酸代谢中涉及的酶活性[19]。

结合本课题研究结果推论得知，Zn2+影响重组大肠杆菌生长及卤醇脱卤酶合成的途径可能为（1）、（2）和（4）。Zn2+通过提高重组大肠杆菌E.coli P84A/MC1061的生理活性和生长速率，同时提高其生物积累量而提高了卤醇脱卤酶的表达量。不但最大酶活的表达量提高了，而且最大酶活的表达时间提前约4 h，此研究不但为重组大肠杆菌表达卤醇脱卤酶的后续研究奠定了基础，同时对工业规模卤醇脱卤酶的高效生产具有较大的指导作用。

参考文献：

[1] Johan E T，van Hylckama V， Tang L X， et al.Halohydrin dehalogenases are structurally and mechanistically related to short-chain dehydrogenases/reductases[J].Journal of Bacteriology，2001，183（17）：5058-5066.

[2] Poelarends G J， van Hylckama V， Marchesi J R， et al. Degradation of 1，2-dibromoethane by mycobacterium sp.strain GP1[J].Journal of Bacteriology，1999（181）：2050-2058.

[3] 李建华，李啸，张娅，等.金属离子对卤醇脱卤酶发酵生产的影响[J].中国酿造，2012，31（3）：127-131.

[4] 陈贵青.不同油菜品种锌富集差异及机理研究[D].重庆：西南大学，2011.

[5] 李永仙，郑飞云，李崎，等.重组大肠杆菌BL21（DE3）-pET28a（+）-bgl诱导表达β-葡聚糖酶的条件优化[J].食品与生物技术学报，2009，28（2）：250-254.

[6] Fox R J， Davis C S，Mundoref E C， et al. Improving catalytic function by ProSAR-driven enzyme evolution[J].Nat Biotechnol，2007（25）：338-344.

[7] 高淑云.微波消解-火焰原子吸收法测定生姜中Cu、Mn、Zn、Cd微量元素[J].中国调味品，2010（7）：0102-0105.

[8] 卜凤泉，刘忠英，胡秀丽，等.测定磷脂中氨基氮的新方法[J].食品科学，2003（5）：87-91.

[9] 梁剑光，朱玲，徐正军.靛酚蓝-分光光度法测定发酵液中氨态氮含量研究[J].分析与检测，2006，32（9）：134-137.

[10] Vallee B L， Falchuk K H.Zinc and gene expression[J].Philos Trans R Soc Lond（Series B：Biological Sciences），1981，294（1071）：185-197.

[11] Leiberman I， Abrams R， Hunt N， et al. Levels of enzyme activity and deoxyribonucleic acid synthesis in mammalian cells cultured from the animal[J].J Biol Chem，1963（238）：3955-3962.

[12] Terhune M W， Sandstead H H.Decreased RNA polymerase activity in mammalian zinc deficiency[J].Science，1972（177）：68-69.

[13] Wu F Y H， Wu C W.The role of zinc in DNA and RNA polymerases[M]//Metal Ions in Biological Systems.New York：Dekker，1983：157-192.

[14] Crossley L G， Falchuk K H， Vallee B L.Messenger ribonucleic acid function and protein synthesis in zinc deficient E.gracilis[J].Biochemistry，1982（21）：5359-5363.

[15] 刘岩松，马培松.锌铜色氨酸配合物的伏安特性研究[J].山东大学报：自然科学版，1999，14（3）：344-346.

[16] 常蓬勃，李志云，杨建堂，等.氮钾锌配施对烟草超氧化物歧化酶和硝酸还原酶活性及根系活力的影响[J].中国农学通报，2008，24（1）：266-270.

[17] 方昭希，王明录，彭代平，等.硝酸还原酶活性与氮素营养的关系[J].植物生理学报，1979，5（2）：123-128.

[18] Kimball S R， Chen S J， Risica R， et al. Effects of zinc deficiency on protein synthesis and expression of specific mRNAs in rat liver[J].Metabolism，1995，44（1）：126-133.

[19] Falchuk K H， Hardy C， Ulpino L， et al. RNA polymerase，manganese，and RNA metabolism of zinc sufficient and deficient E. gracilis[J].Biochem Biophys Res Commun，1977（77）：314-319.